Русский

«Systems Biology and Physiology Reports:Issue #2»

Опубликовано 30 июня 2021

Современные подходы к моделированию тромбоза и гемостаза in vitro

Нарушения в работе системы гемостаза отвечают за большое количество жизнеугрожающих состояний, однако несмотря на многие десятилетия исследований, на сегодняшний день не существует надежных способов корректировать состояние гемостаза без значимых рисков развития тромбозов или кровотечений. Данная ситуация отражает недостаточный уровень понимания ключевых механизмов, которые регулируют гемостатический ответ в норме и при патологии. Для развития фундаментальных представлений о принципах регуляции гемостаза сегодня активно применяются как экспериментальные модели, так и теоретические подходы. Данный обзор посвящен современным in vitro моделям тромбоза и гемостаза и фокусируется на ключевых подходах и инструментах, используемых для изучения процесса свертывания крови вне организма человека. Для воссоздания данного процесса сегодня активно применяются технологии микрофлюидики, а также походы к созданию искусственных сосудов на основе разнообразных гидрогелей. In vitro модели тромбоза традиционно имитируют непроникающее повреждения сосудистой стенки в условиях потока крови и уже более 30 лет исследуются для изучения ключевых процессов, отвечающих за формирование артериальных тромбов – патологических сгустков, которые могут привести к значительному уменьшению кровоснабжения жизненно важных органов. Модели гемостаза in vitro получили активное развитие лишь в последние годы и фокусируются на установлении важных закономерностей образования гемостатических пробок – сгустков, блокирующих кровопотерю в случае проникающего повреждения сосуда. Современные in vitro модели тромбоза и гемостаза используются не только как инструменты для фундаментальных исследований, но и в ряде случаев внедряются в клиническую практику в качестве интегральных методов диагностики нарушений гемостаза.

Создание PDMS-камеры: а) Мастер форму готовят с использованием фотолитографии. Рельеф (обычно сделанный из фоторезиста на кремниевой пластине, показано оранжевым) обычно содержит несколько паттернов для печати на PDMS; b) Рельефную форму (мастер форму) заливают жидкой смесью из основы PDMS с затвердителем; c-d) Часть полимеризованного PDMS затем отрезается и удаляется из формы, e) делаются отверстия для втока и вытока, и присоединяются необходимые трубки. Камера прикрепляется к стеклянному или пластиковому покровному стеклу (серое) с помощью плазменной сварки или вакуумной герметизации.
1 774
0
#гемостаз#тромбоциты#микрофлюидика#гидрогель#цельная кровь#in vitro модели#тромбоз

Фосфотидилинозитол-содержащие везикулы необходимы для активации PLC ζ в соответствие с предсказанием математической модели

Фосфолипаза C ζ (PLCζ) —фермент цитоплазмы и акросомы сперматозоидов млекопитающих. Он катализирует реакцию гидролиза фосфатидилинозитол-4,5-фосфата на инозитол-3-фосфат и диацилглицерин. PLCζ присутствует в акросоме и цитозоле покоящихся сперматозоидов, но не оказывает значительного влияния на их метаболизм. После слияния сперматозоидов и оболочек яйцеклетки активность PLCζ возрастает, поскольку он начинает связывать оболочки яйцеклетки. Причины, по которым PLCζ неактивна в сперматозоидах или соматических клетках любого типа, неизвестны.

В настоящей работе была разработана модель, описывающая активность PLCζ при физиологических концентрациях кальция. Теоретическое моделирование в данной работе объясняет отсутствие активности PLCζ в любом типе клеток млекопитающих, кроме яиц. Было показано, что присутствие богатых фосфоинозитолом везикул необходимо для активности PLCζ в зрелых яйцах млекопитающих.

Схема полной модели. (A) Реакции в ооците. PLCζ - бескальциевый PLCζ, PLCζ_Ca - PLCζ, связанный с одним ионом кальция, PLCζ_2Ca - PLCζ, связанный с двумя ионами кальция, PLCζ_3Ca - с тремя, PLCζ_4Ca - с четырьмя. PLCζ_m - PLCζ, связанный с клеточной мембраной, PLCζ_ (Ca m) - PLCζ, связанный с клеточной мембраной и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca m) - PLCζ, связанный с клеточной мембраной и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca m) - с клеточной мембраной и тремя ионами кальция, PLCζ_ (4Ca m) - с клеточной мембраной и четырьмя ионами кальция. PIP2 и PIP2_v - фосфатидилинозитол-4,5 - бис-фосфат на мембране клеток и везикул соответственно. DAG и DAG_v - диацилглицерол на клеточной мембране и везикулах соответственно. IP3 - инозитол-3-фосфат. PLCζ_v - PLCζ, связанный с везикулами, PLCζ_ (Ca v) - PLCζ, связанный с везикулами и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca v) - PLCζ, связанный с везикулами и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca v) - с везикулами и тремя ионы кальция, PLCζ_ (4Ca v) - с везикулами и четырьмя ионами кальция. (B) Модель сперматозоидов идентична модели ооцита, за исключением отсутствия везикул.
1 107
0
#фосфолипаза Сz#кальциевая сигнализация#сперматозоид#овоцит

Прямое взаимодействие STIM1-ORAI1 не может управлять депо-управляемым входом кальция (SOCE) в тромбоцитах

Депо-управляемый вход кальция (SOCE) играет важную роль в функционировании тромбоцитов. Считается, что механизм SOCE основан на прямом взаимодействии белков STIM1 и ORAI1 со специфической стехиометрией STIM1:ORAI1. Однако в тромбоцитах может осуществляться другой путь. Целью данной работы было исследование механизмов SOCE в тромбоцитах. Мы разработали решеточную математическую модель, которая отражает взаимодействие STIM1-ORAI1, и применили ее как к клеткам HEK, где механизм SOCE хорошо установлен, так и к тромбоцитам. Модель смогла успешно описать поведение STIM1-ORAI1 в клетках HEK. Мы использовали те же параметры для взаимодействия белков и применили их к тромбоцитам. В результате мы продемонстрировали, что количество белков STIM1 на мембране ЭПР не может обеспечить необходимую стехиометрию для правильного депо-управляемого входа кальция в тромбоцитах.

(A) Взаимодействие STIM1-ORAI1 для клеток HEK. Связанные белки представлены коричневым цветом, STIM1 в кластере - зеленым, свободные белки - красным. (B) Зависимость формирования контакта STIM1-ORAI1 от вероятности кластеризации. Пунктирные линии представляют тот же процесс для D=0.01 〖μm〗^2/s (C) Типичное состояние системы при t=100ms для различных вероятностей кластеризации.
1 673
0
#тромбоциты#математическое моделирование#депо-зависимый вход кальция#внутриклеточная сигнализация тромбоцита

Существует значимая корреляция между гиперактивацией тромбоцитов и их потреблением при COVID-19. Пилотное исследование на пациентах из больницы ЦКБ РАН (г. Троицк)

, , , , , , , ,

Известно, что при COVID-19 избыточная свёртываемость крови и, иногда, тромбоцитопения, могут быть характерными для тяжёлого течения заболевания. При этом роль тромбоцитов в патогенезе COVID-19 весьма противоречива. В рамках настоящего исследования нашей задачей было определение степени гиперактивации тромбоцитов пациентов с COVID-19. В исследовании была использована проточная цитометрия цельной крови, окрашенной аннексином-V и лактадгерином («PS + тромбоциты»). Также была разработана стохастическая математическая модель производства и потребления тромбоцитов. Экспериментально было показано, что процент PS + тромбоцитов у пациентов с COVID-19 был в два раза выше, чем у здоровых доноров. При это была получена статистически значимая корреляция между количеством PS+ тромбоцитов и процентом повреждения легких у пациентов. Не было обнаружено никакой связи между гибелью тромбоцитов и терапией пациентов в стационарах. Доля PS+ тромбоцитов была повышена только у пациентов с хроническими заболеваниями лёгких. Хотя у пациентов не наблюдалось выраженных тромбоцитопений, наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов (параметр FSC-A в проточной цитометрии) может указывать на то, что возраст тромбоцитов у пациентов был снижен. Разработанная компьютерная модель производства-утилизации тромбоцитов подтверждает возможность интенсивного потребления тромбоцитов без значимых изменений их количества. Таким образом, можно заключить, что наблюдаемая гиперактивация тромбоцитов при COVID-19 может быть вызвана активацией тромбоцитов в кровотоке, что приводит к их потреблению, но не вызывает значительную тромбоцитопению.

Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.
2 914
0
#КОВИД-19#тромбоциты#свертывание#воспаление#гиперактивация