Существует значимая корреляция между гиперактивацией тромбоцитов и их потреблением при COVID-19. Пилотное исследование на пациентах из больницы ЦКБ РАН (г. Троицк)

https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30183-5

]

. У пациентов с тяжелой формой заболевания последовательно развиваются интерстициальная пневмония, тромбозы и легочная недостаточность

[

2,

Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China

C. Huang, Y. Wang, X. Li, L. Ren, J. Zhao, Y. Hu, L. Zhang, G. Fan, J. Xu, X. Gu, Z. Cheng, T. Yu, J. Xia, Y. Wei, W. Wu, X. Xie, W. Yin, H. Li, M. Liu, Y. Xiao, H. Gao, L. Guo, J. Xie, G. Wang, R. Jiang, Z. Gao, Q. Jin, J. Wang, B. Cao

The Lancet. 2020, 395, 497-506

3

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

https://doi.org/10.1111/jth.14848

]

. Также у пациентов с COVID-19 часто встречается тромбоцитопения, часто коррелирующая с тяжестью заболевания и более высокими показателями смертности

[

4,

Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

https://doi.org/10.1016/j.cca.2020.03.022

5,

Thrombocytopenia is associated with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19) infections: A meta-analysis

G. Lippi, M. Plebani, B. Henry

Clinica Chimica Acta. 2020, 506, 145-148

https://doi.org/10.24287/1726-1708-2021-20-1-184-191

6

Platelets in COVID-19: “innocent by-standers” or active participants?

O. An, A. Martyanov, M. Stepanyan, A. Boldova, S. Rumyantsev, M. Panteleev, F. Ataullakhanov, A. Rumyantsev, A. Sveshnikova

Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. None, 20, 184-191

https://doi.org/10.1016/j.jinf.2020.03.037

]

. Известно, что COVID-19 вызывает сильную воспалительную реакцию – цитокиновый шторм, характеризующийся, среди прочего, повышенными концентрациями интерлейкинов 1β, 6 и 8

[

7

The pathogenesis and treatment of the `Cytokine Storm' in COVID-19

Q. Ye, B. Wang, J. Mao

Journal of Infection. 2020, 80, 607-613

https://doi.org/10.1002/ajh.25829

]

. Это воспалительное состояние является одной из причин серьезных нарушений гемостаза, наблюдаемых у пациентов с тяжелыми формами заболевания

[

8

Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

https://doi.org/10.1111/jth.14850

]

. Тромбоэмболия легочной артерии и тромбоз глубоких вен нижних конечностей являются одними из ведущих причин смертности от COVID-19

[

9

Hypercoagulability of COVID‐19 patients in intensive care unit: A report of thromboelastography findings and other parameters of hemostasis

M. Panigada, N. Bottino, P. Tagliabue, G. Grasselli, C. Novembrino, V. Chantarangkul, A. Pesenti, F. Peyvandi, A. Tripodi

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1738-1742

https://doi.org/10.1111/jth.14817

]

. В менее тяжелых случаях микротромбы все еще присутствовали в легких пациентов

[

10,

Anticoagulant treatment is associated with decreased mortality in severe coronavirus disease 2019 patients with coagulopathy

N. Tang, H. Bai, X. Chen, J. Gong, D. Li, Z. Sun

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1094-1099

https://doi.org/10.1016/j.thromres.2020.04.013

11

Incidence of thrombotic complications in critically ill ICU patients with COVID-19

F. Klok, M. Kruip, N. van der Meer, M. Arbous, D. Gommers, K. Kant, F. Kaptein, J. van Paassen, M. Stals, M. Huisman, H. Endeman

Thrombosis Research. 2020, 191, 145-147

]

.

Тромбоз при COVID-19, предположительно, инициируется макрофагами – клетками, ответственными за воспалительный ответ в легких

[

12,

The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

https://doi.org/10.1038/s41577-020-00470-2

13

Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

https://doi.org/10.1038/s41577-020-00470-2

]

. Макрофаги и эпителиальные клетки легких активируются в результате контакта с вирусом SARS-CoV-2, что усиливает вызывают воспалительную реакцию и привлечение новых макрофагов. Это приводит к активации эндотелиоцитов кровеносных сосудов

[

13,

Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

https://doi.org/10.1038/s41577-021-00536-9

14

Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19

A. Bonaventura, A. Vecchié, L. Dagna, K. Martinod, D. Dixon, B. Van Tassell, F. Dentali, F. Montecucco, S. Massberg, M. Levi, A. Abbate

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 319-329

https://doi.org/10.1016/j.tcm.2015.12.001

]

. Активированные эндотелиальные клетки выставляют на своей поверхности мощный активатор каскада плазменной коагуляции – тканевый фактор (TF)

[

15

Tissue factor as a link between inflammation and coagulation

M. Witkowski, U. Landmesser, U. Rauch

Trends in Cardiovascular Medicine. 2016, 26, 297-303

https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02884

]

. Активированные эндотелиоциты также секретируют фактор фон Виллебранда (vWF), который привлекает тромбоциты к воспаленному эндотелию

[

16

von Willebrand Factor and Platelet Glycoprotein Ib: A Thromboinflammatory Axis in Stroke

F. Denorme, K. Vanhoorelbeke, S. De Meyer

Frontiers in Immunology. None, 10, 2884

]

. Таким образом, вызванная COVID-19 активация эндотелиальных клеток активирует и тромбоцитарное, и плазменное звено гемостаза, что приводит к патологическому тромбозу

[

12

The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

https://doi.org/10.1378/chest.119.1_suppl.64S

]

. Косвенным доказательством роли свертывания крови в патологии COVID-19 является эффективность антикоагулянтной терапии гепарином и его производными

[

17

Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin Mechanisms of Action, Pharmacokinetics, Dosing, Monitoring, Efficacy, and Safety

J. Hirsh, T. Warkentin, S. Shaughnessy, S. Anand, J. Halperin, R. Raschke, C. Granger, E. Ohman, J. Dalen

Chest. 2001, 119, 64S-94S

https://doi.org/10.1002/ajh.25829

]

. Помимо эффективности в ингибировании свёртывания крови, гепарины также известны своим противовоспалительным действием

[

8,

Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

https://doi.org/10.1182/blood.2020006000

18

COVID-19 and its implications for thrombosis and anticoagulation

J. Connors, J. Levy

Blood. 2020, 135, 2033-2040

https://doi.org/10.1136/jim-2020-001628

]

. В то время как эффективность гепарина при терапии COVID-19 была многократно продемонстрирована

[

19,

Higher heparin dosages reduce thromboembolic complications in patients with COVID-19 pneumonia

C. Carallo, F. Pugliese, E. Vettorato, C. Tripolino, L. Delle Donne, G. Guarrera, W. Spagnolli, S. Cozzio

Journal of Investigative Medicine. 2021, 69, 884-887

https://doi.org/10.3389/fmed.2021.647917

20

Risk of Clinically Relevant Venous Thromboembolism in Critically Ill Patients With COVID-19: A Systematic Review and Meta-Analysis

J. Gratz, M. Wiegele, M. Maleczek, H. Herkner, H. Schöchl, E. Chwala, P. Knöbl, E. Schaden

Frontiers in Medicine. 2021, 8, None

https://doi.org/10.1007/s40265-020-01365-1

]

, эффективность антитромбоцитарных препаратов по-прежнему остается спорной

[

21

Is Acetylsalicylic Acid a Safe and Potentially Useful Choice for Adult Patients with COVID-19 ?

V. Bianconi, F. Violi, F. Fallarino, P. Pignatelli, A. Sahebkar, M. Pirro

Drugs. 2020, 80, 1383-1396

https://doi.org/10.1111/jth.13442

]

.

Ключевой фермент плазменного каскада свёртывания крови, тромбин, может также вызывать гиперактивацию тромбоцитов, что запускает их прокоагулянтный ответ

[

22

Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

https://doi.org/10.1111/jth.13442

]

. Прокоагулянтные тромбоциты характеризуются присутствием фосфатидилсерина (PS) на их поверхности, что, в свою очередь, ускоряет процесс свёртывания плазмы крови

[

22,

Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

https://doi.org/10.1182/blood-2016-02-696898

23

Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Blood. 2016, 128, 1745-1755

https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1513473

]

. PS-положительные (PS+) тромбоциты, предположительно, являются одним из маркеров повышенной активации тромбоцитов при кровообращении

[

24,

Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

https://doi.org/10.1152/physrev.00016.2011

25,

New Fundamentals in Hemostasis

H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.311390

26

Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

https://doi.org/10.1093/infdis/jis180

]

. Следует отметить, что эта популяция тромбоцитов быстро выводится из кровотока макрофагами печени

[

27

Platelet Apoptosis and Apoptotic Platelet Clearance by Macrophages in Secondary Dengue Virus Infections

M. Alonzo, T. Lacuesta, E. Dimaano, T. Kurosu, L. Suarez, C. Mapua, Y. Akeda, R. Matias, D. Kuter, S. Nagata, F. Natividad, K. Oishi

The Journal of Infectious Diseases. 2012, 205, 1321-1329

https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1513473

]

. Таким образом, при стабильной гиперактивации тромбоцитов и их переходе в прокоагулянтное состояние, средний возраст всех тромбоцитов в кровотоке будет снижаться. Примечательно, что более молодые тромбоциты, недавно произведённые мегакариоцитами в костном мозге, имеют больший размер

[

24

Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

]

и более склонны к активации, нежели старые тромбоциты

[

28

The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

G. Wool, J. Miller

Pathobiology. 2021, 88, 15-27

https://doi.org/10.1152/physrev.00016.2011

]

, которые утилизируются в печени или селезёнке после 7-10 дней в кровотоке

[

25

New Fundamentals in Hemostasis

H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

]

. Таким образом, средний размер тромбоцитов, а также процентное содержание PS+ тромбоцитов могут быть индикаторами активации и клиренса тромбоцитов в кровотоке.

Механизмы влияния SARS-CoV-2 на функционирование тромбоцитов и роль гемостаза тромбоцитов в патологии COVID-19 в целом в настоящее время активно изучаются. Younes et al. показали, что вирусная РНК присутствовала в тромбоцитах как тяжелых, так и не тяжёлых пациентов в 22% случаев

[

29

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

]

. Напротив, Manne et al. показали, что вирусная РНК не была обнаружена у пациентов с COVID-19 (3 из ОРИТ и один не из ОРИТ) с помощью просвечивающей электронной микроскопии, в то время как экспрессия мРНК гена SARS-CoV-2 N1 присутствовала у 2 из 25 пациентов. Оба они находились в ОРИТ

[

3

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

https://doi.org/10.1002/ajh.25829

]

. Рецептор к ангиотензин-конвертирующему ферменту 2 (ACE-2)

[

8

Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

]

является ключевым путем проникновения SARS-CoV-2 в клетки человека. Однако неясно, присутствует ли этот рецептор на тромбоцитах

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

https://doi.org/10.24287/1726-1708-2021-20-1-184-191

6,

Platelets in COVID-19: “innocent by-standers” or active participants?

O. An, A. Martyanov, M. Stepanyan, A. Boldova, S. Rumyantsev, M. Panteleev, F. Ataullakhanov, A. Rumyantsev, A. Sveshnikova

Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. None, 20, 184-191

29,

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

https://doi.org/10.1182/blood-2012-04-416594

30

The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways

J. Burkhart, M. Vaudel, S. Gambaryan, S. Radau, U. Walter, L. Martens, J. Geiger, A. Sickmann, R. Zahedi

Blood. 2012, 120, e73-e82

]

: есть работы, подтверждающие

[

29,

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

https://doi.org/10.1186/s13045-020-00954-7

31

SARS-CoV-2 binds platelet ACE2 to enhance thrombosis in COVID-19

S. Zhang, Y. Liu, X. Wang, L. Yang, H. Li, Y. Wang, M. Liu, X. Zhao, Y. Xie, Y. Yang, S. Zhang, Z. Fan, J. Dong, Z. Yuan, Z. Ding, Y. Zhang, L. Hu

Journal of Hematology & Oncology. 2020, 13, None

]

и отрицающие

[

3

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]

это. Наконец, покоящиеся тромбоциты пациентов с COVID-19 были увеличены в размере

[

28

The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

G. Wool, J. Miller

Pathobiology. 2021, 88, 15-27

]

и имели повышенную экспрессию P-селектина

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]

. Следует отметить, что у пациентов с COVID-19 было зарегистрировано повышение уровня тромбопоэтина - основного индуктора тромбопоэза тромбоцитов

[

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]

. Следовательно, наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов может быть связано с увеличением тромбопоэтин-зависимой продукции новых (более молодых) клеток

[

29

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1513473

]

.

Подводя итог, тромбоциты пациентов с COVID-19 являются дефектными и причина этого не ясна до конца. В настоящей работе, основываясь на экспериментальных наблюдениях за некрозом и размером тромбоцитов, а также на компьютерном моделировании, мы предполагаем, что наблюдаемые изменения тромбоцитов пациентов с COVID-19 могут быть объяснены их повышенной активацией в кровотоке.

Материалы и методы

Пациенты

32 пациента с диагнозом Коронавирусная инфекция, находившиеся на лечении в ФГБУ «Больница Российской академии наук» (г. Троицк), а также 5 здоровых доноров в возрасте от 21 до 45 лет, которые не болели и не принимали никаких лекарств в течение последнего месяца, участвовали в исследовании. Состояние всех пациентов было охарактеризовано врачами как «легкая степень тяжести» и не требовало искусственной вентиляции легких. Все процедуры соответствуют этическим стандартам Национального комитета по этике исследований и Хельсинкской декларации 1964 года с последующими поправками. Информированное добровольное согласие было получено от каждого из участников, включенных в исследование. В дальнейшем все пациенты были выписаны из больницы в течение 2 недель в связи с улучшением их состояния. Образцы крови пяти пациентов анализировали дважды в разные дни. Исследование одобрено решением Независимого этического комитета Национального исследовательского центра имени Дмитрия Рогачева № 3/2020 от 19 мая 2020 года.

Материалы

Фибриноген-Alexa647, AnnexinV-Alexa647, лактадгерин-FITC (Sony Biotechnology, Сан-Хосе, США), HEPES, бычий сывороточный альбумин, D (+) глюкоза (Sigma, США); NaCl; Na₂HPO₄; KCl; NaHCO₃; MgCl₂; CaCl₂ (Агат-Мед, Москва, Россия).

Проточная цитометрия

Кровь пациентов забиралась в пробирки объемом 3 мл, содержащие цитрат натрия (3,8%). Собранная кровь хранилась при комнатной температуре в течение 30 минут, за которые наблюдалось оседание эритроцитов в нижних слоях пробирки крови. Затем образцы отбирались из верхних 10 процентов объема пробирки и разбавлялись в буфере Тирода (134 мМ NaCl; 0,34 мМ Na₂HPO₄; 2,9 мМ KCl; 12 мМ NaHCO₃; 20 мМ HEPES; 5 мМ глюкозы; 1 мМ MgCl₂; 2 мМ. CaCl₂; BSA 2% по весу; pH 7,3) до концентрации тромбоцитов 1 × 10³ на 1 мл. После этого к каждому образцу добавляли AnnexinV-Alexa647 (2% по объёму) и Lactadherin-FITC (2% по объёму). Затем полученные образцы были инкубированы в течение 10 минут, согласно

[

24

Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

https://doi.org/10.1038/311419a0

]

. Полученные пробы анализировались с помощью проточного цитометра Beckman Coulter Navios. Популяции тромбоцитов и везикул идентифицировали по прямому и боковому светорассеянию (рис. 1А). Аннексин-V-, Лактадгерин-, а также Аннексин-V/Лактадгерин- (двойные) положительные события были идентифицированы, в соответствие с рис. 1В. Событие считалось PS-положительным (PS +), если оно было обнаружено в областях lact +, anV + или lact + anV + (см. Рис. 1B).

Компьютерная модель

Компьютерная модель была построена по принципам клеточного автомата

[

33

Cellular automata as models of complexity

S. Wolfram

Nature. 1984, 311, 419-424

https://doi.org/10.1172/JCI26891

]

: каждая ячейка рассматривается в программе как отдельный объект. В модели присутствовали два типа клеток: тромбоциты и мегакариоциты. У каждого тромбоцита есть две характеристики: возраст и размер. Каждый мегакариоцит имеет только одну характеристику: продукция тромбоцитов = 3500 (тромбоцитов на мегакариоцит,

[

34

The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets

S. Patel

Journal of Clinical Investigation. 2005, 115, 3348-3354

https://doi.org/10.1002/ajh.23562

]

). Age – количество дней (шаг модельного времени), в течение которых существует объект. На каждом временном шаге в костном мозге вырабатывается M новых мегакариоцитов. \( M \) случайное число из \( N(\mu=10 ; \sigma=1) \), где N(_; _) - нормальное распределение. Мегакариоцит может производить тромбоциты только один раз. Модель описывает события, относящиеся к 1 мкл крови. На продукцию тромбоцитов также влияет концентрация тромбопоэтина: \begin{equation} P=(\text { platelet production })^{*} n^{*} T P O \text { , }\tag{1}\end{equation}

где P - количество тромбоцитов, продуцируемых мегакариоцитами, n - случайное значение из \( N(\mu=1 ; \sigma=0.1) \), TPO - параметр, отражающий концентрацию тромбопоэтина в соответствии с уравнением (2): \begin{equation} TPO=1-\frac{1}{1+\left(\frac{N_{T P O}}{P l t}\right)^{h}}\tag{2}\end{equation}

где \( N_{TPO} \) приблизительное количество тромбоцитов, ниже которого начинается выработка ТПО в печени, а Plt - количество тромбоцитов в данный момент времени, параметры \( N_{TPO}=120000 \) и h = 6 были подобраны для описания экспериментальных данных о взаимосвязи между количеством тромбоцитов и концентрацией [TPO] в крови из работы Makar et al.

[

35

Thrombopoietin levels in patients with disorders of platelet production: Diagnostic potential and utility in predicting response to TPO Receptor agonists

R. Makar, O. Zhukov, M. Sahud, D. Kuter

American Journal of Hematology. 2013, 88, 1041-1044

https://doi.org/10.1016/S0049-3848(16)30370-X

]

. В организме человека тромбоциты могут выводиться из кровотока в печени и селезенке, и вероятность клиренса тромбоцитов увеличивается с увеличением возраста тромбоцитов

[

36

Platelet clearance by the hepatic Ashwell-Morrell receptor: mechanisms and biological significance

K. Hoffmeister, H. Falet

Thrombosis Research. 2016, 141, S68-S72

https://doi.org/10.1080/09537104.2021.1922659

]

. Таким образом, в модели на каждом временном шаге каждый тромбоцит может быть удалён с вероятностью: \begin{equation} p_{\text {clear }}=n_{\text {nat }}+n_{\text {thr }}\tag{3}\end{equation}

где n_nat отражает естественное удаление тромбоцитов и представляет собой случайное значение из N(0.625‧age; 0.0125‧age), а n_thr отражает удаление тромбоцитов из-за их участия в образовании тромба и является случайным значением из N(0.625‧K; 0.0125‧K), где K - индекс потребления, который можно варьировать для имитации тяжести тромбоза. Известно, что размер тромбоцитов связан с возрастом тромбоцитов и содержанием РНК

[

37,

Platelet reticulated forms, size indexes, and functional activity. Interactions in healthy volunteers

V. V. Bodrova, O. N. Shustova, S. G. Khaspekova, and A. V. Mazurov

Platelets. 2021, None, 1-6

https://doi.org/10.1111/jth.14895

38,

Ultrastructural, transcriptional, and functional differences between human reticulated and non‐reticulated platelets

L. Hille, M. Lenz, A. Vlachos, B. Grüning, L. Hein, F. Neumann, T. Nührenberg, D. Trenk

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 2034-2046

https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2020.100624

39

Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

https://doi.org/10.3389/fmed.2017.00146

]

. Чтобы смоделировать распределение размеров тромбоцитов, мы ввели в модель уравнение (3), в котором параметр размера пересчитывается из параметра возраста: \begin{equation} \text { size }=50\left(1-\frac{\left(1-\frac{M i n}{M a x}\right)}{1+\left(\frac{M e a n}{a g e}\right)^{h}}\right)\tag{4}\end{equation}

где s₀ отражает исходный размер тромбоцитов и представляет собой значение из N(12; 1) в [fL], параметры Max = 11 [fL] и Min = 6 [fL] отражают распределение по размеру тромбоцитов, обнаруженное у здоровых доноров

[

40

Mean Platelet Volume and Immature Platelet Fraction in Autoimmune Disorders

D. Schmoeller, M. Picarelli, T. Paz Munhoz, C. Poli de Figueiredo, H. Staub

Frontiers in Medicine. 2017, 4, None

https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2020.100624

]

, Среднее значение = 3 [дня] отражает средний возраст тромбоцитов

[

39

Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

https://doi.org/10.1080/09537104.2021.1922659

]

. Формула (3) и коэффициент h = 3 были подобраны для описания данных о взаимосвязи между долей незрелых тромбоцитов, размером тромбоцитов и количеством тромбоцитов

[

37,

Platelet reticulated forms, size indexes, and functional activity. Interactions in healthy volunteers

V. V. Bodrova, O. N. Shustova, S. G. Khaspekova, and A. V. Mazurov

Platelets. 2021, None, 1-6

https://doi.org/10.1111/jth.14895

38,

Ultrastructural, transcriptional, and functional differences between human reticulated and non‐reticulated platelets

L. Hille, M. Lenz, A. Vlachos, B. Grüning, L. Hein, F. Neumann, T. Nührenberg, D. Trenk

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 2034-2046

https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2020.100624

39

Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

]

. Модель построена на Python 3.7.

Клинические данные

Результаты общего анализа крови, биохимического анализа, теста на свертываемость крови, компьютерной томографии, данные ежедневных обследований, возраст и диагнозы пациентов любезно предоставлены больницей с согласия пациентов.

Обработка данных

Данные проточной цитометрии были обработаны с использованием программного обеспечения FlowJo^TM. Статистический анализ проводился посредством GraphPad Prizm.

Результаты и Обсуждение

У пациентов с COVID-19 увеличен размер тромбоцитов, а также увеличена доля фосфатидилсерин положительных тромбоцитов

У исследованных в настоящей работе пациентов с лёгкой формой COVID-19 не наблюдалось выраженной тромбоцитопении: количество тромбоцитов находилось в пределах 139х10³ – 519х10³ тромбоцитов/мкл. Для измерения размера и гиперактивации тромбоцитов, было проведено исследование посредством проточной цитометрии тромбоцитов пациентов, окрашенных лактадгерином и аннексином V (рис. 1). Анализ прямого рассеяния тромбоцитов (FS-A) выявил значительное увеличение FS-A у пациентов по сравнению со здоровыми донорами (среднее значение ± SD: 213 ± 25х10³ абс. ед. для пациентов, 185 ± 20х10³ абс. ед. для здоровых доноров, p = 0,027, рис. 1В). Полученные результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

https://doi.org/10.1080/09537104.2017.1414175

]

. Интересно, что Ковач и др. сообщили, что увеличение размера тромбоцитов характерно для пациентов, страдающих венозной тромбоэмболией

[

41

Characteristics of platelet count and size and diagnostic accuracy of mean platelet volume in patients with venous thromboembolism. A systematic review and meta-analysis

S. Kovács, Z. Csiki, K. Zsóri, Z. Bereczky, A. Shemirani

Platelets. 2019, 30, 139-147

https://doi.org/10.1186/s12575-021-00142-y

]

, что позволяет нам подозревать, что в нашей когорте пациентов с COVID-19 также могут наблюдаться тромботические осложнения

[

42

Anatomical and Pathological Observation and Analysis of SARS and COVID-19: Microthrombosis Is the Main Cause of Death

W. Chen, J. Pan

Biological Procedures Online. 2021, 23, None

https://doi.org/10.1007/s11239-020-02105-8

]

. Маловероятно, что наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов является характерным строго для пациентов, поражённых вирусом SARS-COV-2. Несколько недавних исследований показали, что количество тромбоцитов значительно снижается, а их размер увеличивается при пневмонии, вызванной гриппом

[

43,

Difference of coagulation features between severe pneumonia induced by SARS-CoV2 and non-SARS-CoV2

S. Yin, M. Huang, D. Li, N. Tang

Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2021, 51, 1107-1110

https://doi.org/10.1002/jmv.26645

44

The value of the platelet count and platelet indices in differentiation of COVID‐19 and influenza pneumonia

N. Ozcelik, S. Ozyurt, B. Yilmaz Kara, A. Gumus, U. Sahin

Journal of Medical Virology. 2021, 93, 2221-2226

https://doi.org/10.1007/BF03040424

]

. Тяжелая тромбоцитопения крайне редко встречается у заражённых вирусом Эпштейна-Барра, но эта инфекция часто проявляется умеренным снижением количества тромбоцитов, а также умеренным увеличением размера тромбоцитов в лёгких случаях

[

45

Severe thrombocytopenia as a complication of acute Epstein-Barr virus infection

R. Likic, D. Kuzmanic

Wiener Klinische Wochenschrift. 2004, 116, 47-50

https://doi.org/10.1111/j.1537-2995.2008.01933.x

]

.

Процент PS + тромбоцитов у пациентов был боле чем в два раза выше, чем у здоровых доноров (среднее значение ± SD: 0,74 ± 0,37% для пациентов, 0,29 ± 0,07% для здоровых доноров; p <0,0001, рис. 1D-F). Средний процент PS+ событий был выше для лактадгерина, чем для аннексина V (p = 0,0372, рис. 1E, F), что согласуется с литературными данными о более высокой чувствительности лактадгерина для идентификации фосфатидилсерина на поверхности клеток

[

46

Measurement of phosphatidylserine exposure during storage of platelet concentrates using the novel probe lactadherin: a comparison study with annexin V

A. Albanyan, M. Murphy, J. Rasmussen, C. Heegaard, P. Harrison

Transfusion. 2009, 49, 99-107

]

. Значения, полученные для обоих маркеров PS+ тромбоцитов, хорошо коррелировали друг с другом (r = 0,64, p <0,0001), равно как и общий процент PS+ событий (r = 0,74, p <0,0001 для аннексина V, r = 0,96, p <0,0001 для лактадгерин, см. Таблицу 1). Таким образом, можно сделать вывод, что мы наблюдаем гиперактивацию тромбоцитов при COVID-19, что соответствует ранее опубликованным данным

[

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

https://doi.org/10.1055/a-1401-2706

]

.

Известно, что PS+ тромбоциты образуются в ответ на сильную стимуляцию, например, комбинацией коллагена и тромбина

[

47,

Procoagulant Platelets: Mechanisms of Generation and Action

N. Podoplelova, D. Nechipurenko, A. Ignatova, A. Sveshnikova, M. Panteleev

Hämostaseologie. 2021, 41, 146-153

https://doi.org/10.1182/blood.V90.7.2615

48

Collagen But Not Fibrinogen Surfaces Induce Bleb Formation, Exposure of Phosphatidylserine, and Procoagulant Activity of Adherent Platelets: Evidence for Regulation by Protein Tyrosine Kinase-Dependent Ca2+ Responses

J. Heemskerk, W. Vuist, M. Feijge, C. Reutelingsperger, T. Lindhout

Blood. 1997, 90, 2615-2625

https://doi.org/10.1161/STROKEAHA.114.006492

]

. Наблюдаемое увеличение процента PS + тромбоцитов (0,5–1,5%) у пациентов с Covid-19 может отражать постоянную активацию тромбоцитов в кровообращении

[

49

Coated-Platelets Improve Prediction of Stroke and Transient Ischemic Attack in Asymptomatic Internal Carotid Artery Stenosis

A. Kirkpatrick, A. Tafur, A. Vincent, G. Dale, C. Prodan

Stroke. 2014, 45, 2995-3001

]

. Воспалительный процесс в организме пациента с COVID-19 неразрывно связан с активацией клеток в соседних тканях

[

12

The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

]

и может приводить к активации тромбоцитов из-за их контакта с продуктами тромбообразующих процессов (например, с содержимым тромбоцитов: гранулами, тромбином, АДФ и др.)

[

3

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

https://doi.org/10.1016/j.jinf.2020.03.037

]

. Таким образом, в случае продолжающегося умеренного микротромбоза легких может наблюдаться слабое увеличение количества PS + тромбоцитов. Это соответствует клинической картине исследуемых пациентов, поскольку ни у одного из них не было тяжелых тромботических осложнений в ходе исследования.

. Сравнение процента прокоагулянтных тромбоцитов и их размера у пациентов с COVID-19 и здоровых доноров. A - Выделение области для прямого (FS-A) и бокового (SS-A) рассеяния света: события в красном овале соответствуют тромбоцитам, события в красном квадрате соответствуют тромбоцитам и везикулам. B - Определение доли событий, положительных для аннексина (anV +), лактадгерина (lact +) и фосфатидилсерин-положительных событий (попадающих в обе или одну из областей). C - Сравнение полученных средних размеров тромбоцитов от здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). D - Сравнение полученных значений процента фосфатидилсерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). E - Сравнение полученных значений процента аннексин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). F - Сравнение полученных значений процента лактадгерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). G - Общая информация о пациентах с COVID-19, включенных в исследование. Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; три звездочки означают p <0,001, четыре - p <0,0001.

Figure 1. . Сравнение процента прокоагулянтных тромбоцитов и их размера у пациентов с COVID-19 и здоровых доноров. A - Выделение области для прямого (FS-A) и бокового (SS-A) рассеяния света: события в красном овале соответствуют тромбоцитам, события в красном квадрате соответствуют тромбоцитам и везикулам. B - Определение доли событий, положительных для аннексина (anV +), лактадгерина (lact +) и фосфатидилсерин-положительных событий (попадающих в обе или одну из областей). C - Сравнение полученных средних размеров тромбоцитов от здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). D - Сравнение полученных значений процента фосфатидилсерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). E - Сравнение полученных значений процента аннексин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). F - Сравнение полученных значений процента лактадгерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). G - Общая информация о пациентах с COVID-19, включенных в исследование. Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; три звездочки означают p <0,001, четыре - p <0,0001.

Корреляция параметров тромбоцитов с клинической картиной

Тромбоциты являются не только важными участниками свертывания крови, но также являются важным источником медиаторов воспаления. Помимо антикоагулянтной терапии, применяемой для терапии пациентов с COVID-19, противовоспалительная терапия также проводится с использованием различных подходов: к ним относятся иммунодепрессанты (например, актемра, тоцилизумаб), противомалярийные препараты (гидроксихлорохин) и кортикостероиды

[

7

The pathogenesis and treatment of the `Cytokine Storm' in COVID-19

Q. Ye, B. Wang, J. Mao

Journal of Infection. 2020, 80, 607-613

https://doi.org/10.1189/jlb.0607373

]

. Поэтому нами была проанализирована корреляция между параметрами тромбоцитов, применяемой терапией и сопутствующими заболеваниями пациентов.

Доля PS + тромбоцитов коррелировала (r = 0,69, p <0,01) с повреждением легких (по данным компьютерной томографии, выполненной не позднее, чем через 2 дня от даты исследования тромбоцитов, таблица 1). Эти результаты хорошо согласуются с гипотезой о влиянии воспалительного процесса, происходящего в легких, на систему свертывания, поскольку увеличение площади пораженных альвеол приводит к активации соседних эндотелиальных тканей

[

50,

Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis

M. Schouten, W. Wiersinga, M. Levi, T. van der Poll

Journal of Leukocyte Biology. 2008, 83, 536-545

https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.05.003

51

The lung microvascular endothelium as a therapeutic target in severe influenza

S. Armstrong, S. Mubareka, W. Lee

Antiviral Research. 2013, 99, 113-118

]

. Кроме того, наблюдалась отрицательная корреляция (r = -0,49, p <0,05) между общим количеством тромбоцитов и долей прокоагулянтных клеток. Мы предполагаем, что причиной этих изменений может быть высокое потребление тромбоцитов (таблица 1). Процент PS + тромбоцитов и количество тромбоцитов коррелировали с уровнем фибриногена в крови (p <0,05 и p <0,001 соответственно, таблица 1). Этот результат можно объяснить тромбообразованием, приводящим к повышенному потреблению факторов свертывания крови и тромбоцитов. Благодаря этому печень компенсирует потребление белка

[

28,

The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

G. Wool, J. Miller

Pathobiology. 2021, 88, 15-27

https://doi.org/10.1111/jth.14848

52

Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

https://doi.org/10.1111/jth.14810

]

. Не было обнаружено корреляции между долей прокоагулянтных тромбоцитов и С-реактивным белком или D-димером (см. Таблицу 1).

Корреляция параметров тромбоцитов и применяемой терапии

Каждому из включённых в исследование пациентов назначалась тромбопрофилактика

[

53

ISTH interim guidance on recognition and management of coagulopathy in COVID‐19

J. Thachil, N. Tang, S. Gando, A. Falanga, M. Cattaneo, M. Levi, C. Clark, T. Iba

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1023-1026

https://doi.org/10.1056/NEJM200104263441704

]

. Известно, что использование гепаринов может привести к транзиторной гепарин-индуцированной тромбоцитопении (ГИТ)

[

54,

Temporal Aspects of Heparin-Induced Thrombocytopenia

T. Warkentin, J. Kelton

New England Journal of Medicine. 2001, 344, 1286-1292

https://doi.org/10.1056/NEJM199505183322003

55

Heparin-Induced Thrombocytopenia in Patients Treated with Low-Molecular-Weight Heparin or Unfractionated Heparin

T. Warkentin, M. Levine, J. Hirsh, P. Horsewood, R. Roberts, M. Gent, J. Kelton

New England Journal of Medicine. 1995, 332, 1330-1336

https://doi.org/10.1007/s11239-021-02436-0

]

. Однако в нашем исследовании этого не наблюдалось. Количество PS + тромбоцитов у пациентов, получавших гепарины, также не отличалось по сравнению с другими пациентами с COVID-19 (рис. 2A). Иногда пациентам с COVID-19 также назначают антиагрегантные препараты

[

56

Use of antiplatelet drugs and the risk of mortality in patients with COVID-19: a meta‐analysis

C. S. Kow and S. S. Hasan

Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2021, None, None

https://doi.org/10.1093/infdis/jiv392

]

. У двух из трех пациентов, получавших антитромбоцитарные препараты до госпитализации в связи с коронавирусной инфекцией, количество PS + тромбоцитов было значительно ниже, чем у других пациентов с COVID-19 (рис. 2A).

Согласно ранее опубликованным рекомендациям, пациентам в больнице назначают другие терапевтические средства, в том числе антиретровирусный препарат лопинавир

[

57,

Treatment With Lopinavir/Ritonavir or Interferon-β1b Improves Outcome of MERS-CoV Infection in a Nonhuman Primate Model of Common Marmoset

J. Chan, Y. Yao, M. Yeung, W. Deng, L. Bao, L. Jia, F. Li, C. Xiao, H. Gao, P. Yu, J. Cai, H. Chu, J. Zhou, H. Chen, C. Qin, K. Yuen

Journal of Infectious Diseases. 2015, 212, 1904-1913

https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31042-4

58

Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir–ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial

I. Hung, K. Lung, E. Tso, R. Liu, T. Chung, M. Chu, Y. Ng, J. Lo, J. Chan, A. Tam, H. Shum, V. Chan, A. Wu, K. Sin, W. Leung, W. Law, D. Lung, S. Sin, P. Yeung, C. Yip, R. Zhang, A. Fung, E. Yan, K. Leung, J. Ip, A. Chu, W. Chan, A. Ng, R. Lee, K. Fung, A. Yeung, T. Wu, J. Chan, W. Yan, W. Chan, J. Chan, A. Lie, O. Tsang, V. Cheng, T. Que, C. Lau, K. Chan, K. To, K. Yuen

The Lancet. 2020, 395, 1695-1704

https://doi.org/10.1016/j.thromres.2020.06.033

]

. Различий в количестве прокоагулянтных тромбоцитов между группами пациентов, которые принимали и не принимали комбинацию лопинавир-ритонавир не было обнаружено (рис. 2А).

При сравнении групп пациентов на наличие хронических заболеваний статистически значимые различия (p = 0,027) выявлены только для группы пациентов с хроническими заболеваниями легких. Процент событий PS + при наличии заболевания был ниже, чем при отсутствии (среднее значение ± стандартное отклонение: 0,81 ± 0,37% для отсутствия, 0,41 ± 0,17% для присутствия, рис. 2B), что может быть связано с наличием компенсаторный механизм в системе свертывания крови этих пациентов. Когорта пациентов, включенных в это исследование, весьма неоднородна с точки зрения возраста и состояния здоровья. Однако отсутствие значимых различий между разными группами пациентов (рис. 2B, рис. S1) и отсутствие наблюдаемого измененного фенотипа тромбоцитов при хронических заболеваниях

[

59,

Small procoagulant platelets in diabetes type 2

M. Edvardsson, M. Oweling, P. Järemo

Thrombosis Research. 2020, 195, 1-7

https://doi.org/10.1097/MOG.0000000000000635

60,

Coagulation testing and management in liver disease patients

M. Stotts, J. Davis, N. Shah

Current Opinion in Gastroenterology. 2020, 36, 169-176

https://doi.org/10.1080/09537104.2018.1499890

61,

Platelet and coagulation disorders in newly diagnosed patients with pulmonary arterial hypertension

E. Vrigkou, I. Tsangaris, S. Bonovas, P. Kopterides, E. Kyriakou, D. Konstantonis, A. Pappas, A. Anthi, A. Gialeraki, S. Orfanos, A. Armaganidis, A. Tsantes

Platelets. 2019, 30, 646-651

https://doi.org/10.3402/jev.v3.25625

62

Levels of procoagulant microvesicles are elevated after traumatic injury and platelet microvesicles are negatively correlated with mortality

N. Curry, A. Raja, J. Beavis, S. Stanworth, P. Harrison

Journal of Extracellular Vesicles. 2014, 3, 25625

]

позволяет нам утверждать, что данный фенотип сформировался именно по причине COVID-19.

Связь положительных по фосфатидилсерину событий с клиническими параметрами пациентов, наличием хронических заболеваний и проводимой терапией.A - Сравнение результатов пациентов на терапии, которую они принимают (3 разные группы по количеству низкомолекулярных гепаринов; группа, принимавшая антикоагулянты и антиагреганты; группа, принимавшая препараты против ВИЧ, и не принимавшая их). При использовании статистики критерия Манна-Уитни достоверных различий между группами не обнаружено. B - Сравнение процента фосфатидилсерин-положительных событий для групп пациентов, страдающих различными хроническими заболеваниями (сахарный диабет II типа (Diabetes), заболевания желудочно-кишечного тракта (Digestive), легких (Lungs), сердечно-сосудистые (Cardiovascular), хроническая артериальная гипертензия (CAH)). Зеленый прямоугольник показывает нормальный диапазон, полученный для здоровых доноров (среднее ± 2 стандартных отклонения). Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; одна звездочка означает p <0,05.

Figure 2. Связь положительных по фосфатидилсерину событий с клиническими параметрами пациентов, наличием хронических заболеваний и проводимой терапией.A - Сравнение результатов пациентов на терапии, которую они принимают (3 разные группы по количеству низкомолекулярных гепаринов; группа, принимавшая антикоагулянты и антиагреганты; группа, принимавшая препараты против ВИЧ, и не принимавшая их). При использовании статистики критерия Манна-Уитни достоверных различий между группами не обнаружено. B - Сравнение процента фосфатидилсерин-положительных событий для групп пациентов, страдающих различными хроническими заболеваниями (сахарный диабет II типа (Diabetes), заболевания желудочно-кишечного тракта (Digestive), легких (Lungs), сердечно-сосудистые (Cardiovascular), хроническая артериальная гипертензия (CAH)). Зеленый прямоугольник показывает нормальный диапазон, полученный для здоровых доноров (среднее ± 2 стандартных отклонения). Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; одна звездочка означает p <0,05.

Компьютерная модель предсказывает, что в основе тромбоцитопатии COVID-19 лежит усиленное потребление тромбоцитов

Фенотип тромбоцитов у пациентов с COVID-19 оказался достаточно характерным: в то время как ни в литературе, ни в нашем исследовании не было обнаружено значительной тромбоцитопении

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

28,

The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

G. Wool, J. Miller

Pathobiology. 2021, 88, 15-27

29,

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

https://doi.org/10.1016/S0049-3848(16)30370-X

]

, наблюдалось одновременное увеличение размера тромбоцитов и доли PS + тромбоцитов. Чтобы понять, может ли такой фенотип быть вызван потреблением тромбоцитов из-за тромбоза, мы построили модель продукции, старения и клиренса тромбоцитов (рис. 3А).

В модели, в отсутствие дополнительного потребления тромбоцитов, среднее количество тромбоцитов составило от 155 × 10³ тромбоцитов / мкл до 177 × 10³ тромбоцитов / мкл (рис. 3B). Количество тромбоцитов и размер тромбоцитов стохастически колебались (рис. S2 A и B, соответственно). Введение дополнительного потребления, не влиявшего значительно на количество тромбоцитов (∆Plt <25 000 / мкл), привело к значительному увеличению размера тромбоцитов (рис. 3B, C; S2A, B). Повышенное потребление также привело к «омоложению» тромбоцитов (рис. S2C, D). Увеличение потребления тромбоцитов выше 2 привело к легкой тромбоцитопении и ещё более выраженному снижению среднего возраста тромбоцитов (рис. 3B). Тяжелая тромбоцитопения появлялась при потреблении тромбоцитов выше K = 5, что соответствовало потреблению более половины произведенных тромбоцитов (рис. 3B, S2). Дополнительный анализ чувствительности показал, что результаты модели были наиболее чувствительны к параметрам синтеза ТПО, потребления тромбоцитов и клиренса тромбоцитов. Эти реакции выделены красным цветом (рис. 3А).

Примечательно, что доля PS+ тромбоцитов слабо коррелировала со средними значениями FS-A (таблица 1). Этот вывод подтверждает гипотезу о том, что при COVID-19 тромбоциты потребляются из-за тромбоза, что приводит к увеличению фракции PS + тромбоцитов, снижению среднего возраста тромбоцитов и, следовательно, увеличению их размера. Слабость корреляции может быть вызвана повышенным клиренсом PS+ тромбоцитов печенью и селезенкой

[

36

Platelet clearance by the hepatic Ashwell-Morrell receptor: mechanisms and biological significance

K. Hoffmeister, H. Falet

Thrombosis Research. 2016, 141, S68-S72

https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.311390

]

. Однако следует также иметь в виду, что клетки во время эксперимента находились в состоянии покоя, и сравнение степени активации для пациентов и здоровых доноров не проводилось.

Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.

Figure 3. Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.

Заключение

В рамках данной работы мы наблюдали значительное увеличение доли PS+ тромбоцитов у пациентов с COVID-19 (рис. 1). Это явление не коррелирует ни с терапевтическими вмешательствами, проводимыми в стационаре, ни с хроническими заболеваниями пациентов (рис. 2). Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов и экспозиция фосфатидилсерина, в основном, вызваны COVID-19 и связанной с ним пневмонией. Ранее сообщалось, что такие изменения могут быть вызваны активным тромбозом

[

26,

Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

https://doi.org/10.1080/09537104.2017.1414175

41

Characteristics of platelet count and size and diagnostic accuracy of mean platelet volume in patients with venous thromboembolism. A systematic review and meta-analysis

S. Kovács, Z. Csiki, K. Zsóri, Z. Bereczky, A. Shemirani

Platelets. 2019, 30, 139-147

]

. Предлагаемая вычислительная модель демонстрирует, что умеренное потребление, которое не приводит к выраженной тромбоцитопении, может привести к увеличению среднего объема тромбоцитов в 1,3 раза, наблюдаемому у пациентов с COVID-19 (рис. 1).

Основываясь на наших экспериментальных результатах и теоретических выводах, мы предлагаем следующую схему воздействия COVID-19 на тромбоциты человека:

• SARS-CoV-2 вызывает повреждение легких. Это приводит к активации эндотелия кровеносных сосудов и выставлению тканевого фактора (ТФ) в кровоток

[

12,

The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

https://doi.org/10.1038/s41577-020-00470-2

13

Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

]

;

• ТФ вызывает тромбообразование и потребление тромбоцитов;

• Доля PS+ тромбоцитов увеличивается (рис. 1) в результате сильной активации тромбоцитов, а продукция тромбоцитов увеличивается за счет мегакариоцитов (рис. 3)

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

29,

Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

32

Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]

из-за увеличения синтеза ТПО печенью

[

3

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]

;

• Происходит легкое снижение количества тромбоцитов

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

https://doi.org/10.1111/jth.14848

52

Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

]

, в то время как размер тромбоцитов значительно увеличивается

[

3,

Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

28

The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

G. Wool, J. Miller

Pathobiology. 2021, 88, 15-27