Русский

Существует значимая корреляция между гиперактивацией тромбоцитов и их потреблением при COVID-19. Пилотное исследование на пациентах из больницы ЦКБ РАН (г. Троицк)

, , , , , , , ,

Введение

Вирус SARS-CoV-2 стал причиной пандемии, разразившейся во всем мире в 2020 году
[
1
Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia

Q. Li, X. Guan, P. Wu, X. Wang, L. Zhou, Y. Tong, R. Ren, K. Leung, E. Lau, J. Wong, X. Xing, N. Xiang, Y. Wu, C. Li, Q. Chen, D. Li, T. Liu, J. Zhao, M. Liu, W. Tu, C. Chen, L. Jin, R. Yang, Q. Wang, S. Zhou, R. Wang, H. Liu, Y. Luo, Y. Liu, G. Shao, H. Li, Z. Tao, Y. Yang, Z. Deng, B. Liu, Z. Ma, Y. Zhang, G. Shi, T. Lam, J. Wu, G. Gao, B. Cowling, B. Yang, G. Leung, Z. Feng

New England Journal of Medicine. 2020, 382, 1199-1207

]
. У пациентов с тяжелой формой заболевания последовательно развиваются интерстициальная пневмония, тромбозы и легочная недостаточность
[
2,
Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China

C. Huang, Y. Wang, X. Li, L. Ren, J. Zhao, Y. Hu, L. Zhang, G. Fan, J. Xu, X. Gu, Z. Cheng, T. Yu, J. Xia, Y. Wei, W. Wu, X. Xie, W. Yin, H. Li, M. Liu, Y. Xiao, H. Gao, L. Guo, J. Xie, G. Wang, R. Jiang, Z. Gao, Q. Jin, J. Wang, B. Cao

The Lancet. 2020, 395, 497-506

3
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
. Также у пациентов с COVID-19 часто встречается тромбоцитопения, часто коррелирующая с тяжестью заболевания и более высокими показателями смертности
[
4,
Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

6
Platelets in COVID-19: “innocent by-standers” or active participants?

O. An, A. Martyanov, M. Stepanyan, A. Boldova, S. Rumyantsev, M. Panteleev, F. Ataullakhanov, A. Rumyantsev, A. Sveshnikova

Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. None, 20, 184-191

]
. Известно, что COVID-19 вызывает сильную воспалительную реакцию – цитокиновый шторм, характеризующийся, среди прочего, повышенными концентрациями интерлейкинов 1β, 6 и 8
. Это воспалительное состояние является одной из причин серьезных нарушений гемостаза, наблюдаемых у пациентов с тяжелыми формами заболевания
[
8
Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

]
. Тромбоэмболия легочной артерии и тромбоз глубоких вен нижних конечностей являются одними из ведущих причин смертности от COVID-19
[
9
Hypercoagulability of COVID‐19 patients in intensive care unit: A report of thromboelastography findings and other parameters of hemostasis

M. Panigada, N. Bottino, P. Tagliabue, G. Grasselli, C. Novembrino, V. Chantarangkul, A. Pesenti, F. Peyvandi, A. Tripodi

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1738-1742

]
. В менее тяжелых случаях микротромбы все еще присутствовали в легких пациентов
[
11
Incidence of thrombotic complications in critically ill ICU patients with COVID-19

F. Klok, M. Kruip, N. van der Meer, M. Arbous, D. Gommers, K. Kant, F. Kaptein, J. van Paassen, M. Stals, M. Huisman, H. Endeman

Thrombosis Research. 2020, 191, 145-147

]
.
Тромбоз при COVID-19, предположительно, инициируется макрофагами – клетками, ответственными за воспалительный ответ в легких
[
12,
The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

13
Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

]
. Макрофаги и эпителиальные клетки легких активируются в результате контакта с вирусом SARS-CoV-2, что усиливает вызывают воспалительную реакцию и привлечение новых макрофагов. Это приводит к активации эндотелиоцитов кровеносных сосудов
[
13,
Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

14
Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19

A. Bonaventura, A. Vecchié, L. Dagna, K. Martinod, D. Dixon, B. Van Tassell, F. Dentali, F. Montecucco, S. Massberg, M. Levi, A. Abbate

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 319-329

]
. Активированные эндотелиальные клетки выставляют на своей поверхности мощный активатор каскада плазменной коагуляции – тканевый фактор (TF)
[
15
Tissue factor as a link between inflammation and coagulation

M. Witkowski, U. Landmesser, U. Rauch

Trends in Cardiovascular Medicine. 2016, 26, 297-303

]
. Активированные эндотелиоциты также секретируют фактор фон Виллебранда (vWF), который привлекает тромбоциты к воспаленному эндотелию
. Таким образом, вызванная COVID-19 активация эндотелиальных клеток активирует и тромбоцитарное, и плазменное звено гемостаза, что приводит к патологическому тромбозу
[
12
The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

]
. Косвенным доказательством роли свертывания крови в патологии COVID-19 является эффективность антикоагулянтной терапии гепарином и его производными
[
17
Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin Mechanisms of Action, Pharmacokinetics, Dosing, Monitoring, Efficacy, and Safety

J. Hirsh, T. Warkentin, S. Shaughnessy, S. Anand, J. Halperin, R. Raschke, C. Granger, E. Ohman, J. Dalen

Chest. 2001, 119, 64S-94S

]
. Помимо эффективности в ингибировании свёртывания крови, гепарины также известны своим противовоспалительным действием
[
8,
Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

]
. В то время как эффективность гепарина при терапии COVID-19 была многократно продемонстрирована
[
19,
Higher heparin dosages reduce thromboembolic complications in patients with COVID-19 pneumonia

C. Carallo, F. Pugliese, E. Vettorato, C. Tripolino, L. Delle Donne, G. Guarrera, W. Spagnolli, S. Cozzio

Journal of Investigative Medicine. 2021, 69, 884-887

20
Risk of Clinically Relevant Venous Thromboembolism in Critically Ill Patients With COVID-19: A Systematic Review and Meta-Analysis

J. Gratz, M. Wiegele, M. Maleczek, H. Herkner, H. Schöchl, E. Chwala, P. Knöbl, E. Schaden

Frontiers in Medicine. 2021, 8, None

]
, эффективность антитромбоцитарных препаратов по-прежнему остается спорной
[
21
Is Acetylsalicylic Acid a Safe and Potentially Useful Choice for Adult Patients with COVID-19 ?

V. Bianconi, F. Violi, F. Fallarino, P. Pignatelli, A. Sahebkar, M. Pirro

Drugs. 2020, 80, 1383-1396

]
.
Ключевой фермент плазменного каскада свёртывания крови, тромбин, может также вызывать гиперактивацию тромбоцитов, что запускает их прокоагулянтный ответ
[
22
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
. Прокоагулянтные тромбоциты характеризуются присутствием фосфатидилсерина (PS) на их поверхности, что, в свою очередь, ускоряет процесс свёртывания плазмы крови
[
22,
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

23
Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Blood. 2016, 128, 1745-1755

]
. PS-положительные (PS+) тромбоциты, предположительно, являются одним из маркеров повышенной активации тромбоцитов при кровообращении
[
24,
Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

25,
New Fundamentals in Hemostasis

H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

26
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

]
. Следует отметить, что эта популяция тромбоцитов быстро выводится из кровотока макрофагами печени
[
27
Platelet Apoptosis and Apoptotic Platelet Clearance by Macrophages in Secondary Dengue Virus Infections

M. Alonzo, T. Lacuesta, E. Dimaano, T. Kurosu, L. Suarez, C. Mapua, Y. Akeda, R. Matias, D. Kuter, S. Nagata, F. Natividad, K. Oishi

The Journal of Infectious Diseases. 2012, 205, 1321-1329

]
. Таким образом, при стабильной гиперактивации тромбоцитов и их переходе в прокоагулянтное состояние, средний возраст всех тромбоцитов в кровотоке будет снижаться. Примечательно, что более молодые тромбоциты, недавно произведённые мегакариоцитами в костном мозге, имеют больший размер
[
24
Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

]
и более склонны к активации, нежели старые тромбоциты
, которые утилизируются в печени или селезёнке после 7-10 дней в кровотоке
[
25
New Fundamentals in Hemostasis

H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

]
. Таким образом, средний размер тромбоцитов, а также процентное содержание PS+ тромбоцитов могут быть индикаторами активации и клиренса тромбоцитов в кровотоке.
Механизмы влияния SARS-CoV-2 на функционирование тромбоцитов и роль гемостаза тромбоцитов в патологии COVID-19 в целом в настоящее время активно изучаются. Younes et al. показали, что вирусная РНК присутствовала в тромбоцитах как тяжелых, так и не тяжёлых пациентов в 22% случаев
[
29
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

]
. Напротив, Manne et al. показали, что вирусная РНК не была обнаружена у пациентов с COVID-19 (3 ​​из ОРИТ и один не из ОРИТ) с помощью просвечивающей электронной микроскопии, в то время как экспрессия мРНК гена SARS-CoV-2 N1 присутствовала у 2 из 25 пациентов. Оба они находились в ОРИТ
[
3
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
. Рецептор к ангиотензин-конвертирующему ферменту 2 (ACE-2)
[
8
Hematological findings and complications of COVID ‐19

E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

]
является ключевым путем проникновения SARS-CoV-2 в клетки человека. Однако неясно, присутствует ли этот рецептор на тромбоцитах
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

6,
Platelets in COVID-19: “innocent by-standers” or active participants?

O. An, A. Martyanov, M. Stepanyan, A. Boldova, S. Rumyantsev, M. Panteleev, F. Ataullakhanov, A. Rumyantsev, A. Sveshnikova

Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. None, 20, 184-191

29,
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

]
: есть работы, подтверждающие
[
29,
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

31
SARS-CoV-2 binds platelet ACE2 to enhance thrombosis in COVID-19

S. Zhang, Y. Liu, X. Wang, L. Yang, H. Li, Y. Wang, M. Liu, X. Zhao, Y. Xie, Y. Yang, S. Zhang, Z. Fan, J. Dong, Z. Yuan, Z. Ding, Y. Zhang, L. Hu

Journal of Hematology & Oncology. 2020, 13, None

]
и отрицающие
[
3
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
это. Наконец, покоящиеся тромбоциты пациентов с COVID-19 были увеличены в размере
и имели повышенную экспрессию P-селектина
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
. Следует отметить, что у пациентов с COVID-19 было зарегистрировано повышение уровня тромбопоэтина - основного индуктора тромбопоэза тромбоцитов
[
32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
. Следовательно, наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов может быть связано с увеличением тромбопоэтин-зависимой продукции новых (более молодых) клеток
[
29
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

]
.

Подводя итог, тромбоциты пациентов с COVID-19 являются дефектными и причина этого не ясна до конца. В настоящей работе, основываясь на экспериментальных наблюдениях за некрозом и размером тромбоцитов, а также на компьютерном моделировании, мы предполагаем, что наблюдаемые изменения тромбоцитов пациентов с COVID-19 могут быть объяснены их повышенной активацией в кровотоке.

Материалы и методы

Пациенты

32 пациента с диагнозом Коронавирусная инфекция, находившиеся на лечении в ФГБУ «Больница Российской академии наук» (г. Троицк), а также 5 здоровых доноров в возрасте от 21 до 45 лет, которые не болели и не принимали никаких лекарств в течение последнего месяца, участвовали в исследовании. Состояние всех пациентов было охарактеризовано врачами как «легкая степень тяжести» и не требовало искусственной вентиляции легких. Все процедуры соответствуют этическим стандартам Национального комитета по этике исследований и Хельсинкской декларации 1964 года с последующими поправками. Информированное добровольное согласие было получено от каждого из участников, включенных в исследование. В дальнейшем все пациенты были выписаны из больницы в течение 2 недель в связи с улучшением их состояния. Образцы крови пяти пациентов анализировали дважды в разные дни. Исследование одобрено решением Независимого этического комитета Национального исследовательского центра имени Дмитрия Рогачева № 3/2020 от 19 мая 2020 года.

Материалы

Фибриноген-Alexa647, AnnexinV-Alexa647, лактадгерин-FITC (Sony Biotechnology, Сан-Хосе, США), HEPES, бычий сывороточный альбумин, D (+) глюкоза (Sigma, США); NaCl; Na2HPO4; KCl; NaHCO3; MgCl2; CaCl2 (Агат-Мед, Москва, Россия).

Проточная цитометрия

Кровь пациентов забиралась в пробирки объемом 3 мл, содержащие цитрат натрия (3,8%). Собранная кровь хранилась при комнатной температуре в течение 30 минут, за которые наблюдалось оседание эритроцитов в нижних слоях пробирки крови. Затем образцы отбирались из верхних 10 процентов объема пробирки и разбавлялись в буфере Тирода (134 мМ NaCl; 0,34 мМ Na2HPO4; 2,9 мМ KCl; 12 мМ NaHCO3; 20 мМ HEPES; 5 мМ глюкозы; 1 мМ MgCl2; 2 мМ. CaCl2; BSA 2% по весу; pH 7,3) до концентрации тромбоцитов 1 × 103 на 1 мл. После этого к каждому образцу добавляли AnnexinV-Alexa647 (2% по объёму) и Lactadherin-FITC (2% по объёму). Затем полученные образцы были инкубированы в течение 10 минут, согласно

[
24
Flow cytometry for pediatric platelets

A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

Platelets. 2019, 30, 428-437

]
. Полученные пробы анализировались с помощью проточного цитометра Beckman Coulter Navios. Популяции тромбоцитов и везикул идентифицировали по прямому и боковому светорассеянию (рис. 1А). Аннексин-V-, Лактадгерин-, а также Аннексин-V/Лактадгерин- (двойные) положительные события были идентифицированы, в соответствие с рис. 1В. Событие считалось PS-положительным (PS +), если оно было обнаружено в областях lact +, anV + или lact + anV + (см. Рис. 1B).

Компьютерная модель

Компьютерная модель была построена по принципам клеточного автомата
: каждая ячейка рассматривается в программе как отдельный объект. В модели присутствовали два типа клеток: тромбоциты и мегакариоциты. У каждого тромбоцита есть две характеристики: возраст и размер. Каждый мегакариоцит имеет только одну характеристику: продукция тромбоцитов = 3500 (тромбоцитов на мегакариоцит,
). Age – количество дней (шаг модельного времени), в течение которых существует объект. На каждом временном шаге в костном мозге вырабатывается M новых мегакариоцитов. \( M \) случайное число из \( N(\mu=10 ; \sigma=1) \), где N(_; _) - нормальное распределение. Мегакариоцит может производить тромбоциты только один раз. Модель описывает события, относящиеся к 1 мкл крови. На продукцию тромбоцитов также влияет концентрация тромбопоэтина: \begin{equation} P=(\text { platelet production })^{*} n^{*} T P O \text { , }\tag{1}\end{equation}

где P - количество тромбоцитов, продуцируемых мегакариоцитами, n - случайное значение из \( N(\mu=1 ; \sigma=0.1) \), TPO - параметр, отражающий концентрацию тромбопоэтина в соответствии с уравнением (2): \begin{equation} TPO=1-\frac{1}{1+\left(\frac{N_{T P O}}{P l t}\right)^{h}}\tag{2}\end{equation}                

где \( N_{TPO} \) приблизительное количество тромбоцитов, ниже которого начинается выработка ТПО в печени, а Plt - количество тромбоцитов в данный момент времени, параметры \( N_{TPO}=120000 \) и h = 6 были подобраны для описания экспериментальных данных о взаимосвязи между количеством тромбоцитов и концентрацией [TPO] в крови из работы Makar et al.

. В организме человека тромбоциты могут выводиться из кровотока в печени и селезенке, и вероятность клиренса тромбоцитов увеличивается с увеличением возраста тромбоцитов
. Таким образом, в модели на каждом временном шаге каждый тромбоцит может быть удалён с вероятностью: \begin{equation} p_{\text {clear }}=n_{\text {nat }}+n_{\text {thr }}\tag{3}\end{equation}                                    

где nnat отражает естественное удаление тромбоцитов и представляет собой случайное значение из N(0.625‧age; 0.0125‧age), а nthr отражает удаление тромбоцитов из-за их участия в образовании тромба и является случайным значением из N(0.625‧K; 0.0125‧K), где K - индекс потребления, который можно варьировать для имитации тяжести тромбоза. Известно, что размер тромбоцитов связан с возрастом тромбоцитов и содержанием РНК

[
38,
Ultrastructural, transcriptional, and functional differences between human reticulated and non‐reticulated platelets

L. Hille, M. Lenz, A. Vlachos, B. Grüning, L. Hein, F. Neumann, T. Nührenberg, D. Trenk

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 2034-2046

39
Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

]
. Чтобы смоделировать распределение размеров тромбоцитов, мы ввели в модель уравнение (3), в котором параметр размера пересчитывается из параметра возраста: \begin{equation} \text { size }=50\left(1-\frac{\left(1-\frac{M i n}{M a x}\right)}{1+\left(\frac{M e a n}{a g e}\right)^{h}}\right)\tag{4}\end{equation}                                 

где s0 отражает исходный размер тромбоцитов и представляет собой значение из N(12; 1) в [fL], параметры Max = 11 [fL] и Min = 6 [fL] отражают распределение по размеру тромбоцитов, обнаруженное у здоровых доноров

[
40
Mean Platelet Volume and Immature Platelet Fraction in Autoimmune Disorders

D. Schmoeller, M. Picarelli, T. Paz Munhoz, C. Poli de Figueiredo, H. Staub

Frontiers in Medicine. 2017, 4, None

]
, Среднее значение = 3 [дня] отражает средний возраст тромбоцитов
[
39
Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

]
. Формула (3) и коэффициент h = 3 были подобраны для описания данных о взаимосвязи между долей незрелых тромбоцитов, размером тромбоцитов и количеством тромбоцитов
[
38,
Ultrastructural, transcriptional, and functional differences between human reticulated and non‐reticulated platelets

L. Hille, M. Lenz, A. Vlachos, B. Grüning, L. Hein, F. Neumann, T. Nührenberg, D. Trenk

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 2034-2046

39
Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

]
. Модель построена на Python 3.7.

Клинические данные

Результаты общего анализа крови, биохимического анализа, теста на свертываемость крови, компьютерной томографии, данные ежедневных обследований, возраст и диагнозы пациентов любезно предоставлены больницей с согласия пациентов.

Обработка данных

Данные проточной цитометрии были обработаны с использованием программного обеспечения FlowJoTM. Статистический анализ проводился посредством GraphPad Prizm.

Результаты и Обсуждение

У пациентов с COVID-19 увеличен размер тромбоцитов, а также увеличена доля фосфатидилсерин положительных тромбоцитов

У исследованных в настоящей работе пациентов с лёгкой формой COVID-19 не наблюдалось выраженной тромбоцитопении: количество тромбоцитов находилось в пределах 139х103 – 519х103 тромбоцитов/мкл. Для измерения размера и гиперактивации тромбоцитов, было проведено исследование посредством проточной цитометрии тромбоцитов пациентов, окрашенных лактадгерином и аннексином V (рис. 1). Анализ прямого рассеяния тромбоцитов (FS-A) выявил значительное увеличение FS-A у пациентов по сравнению со здоровыми донорами (среднее значение ± SD: 213 ± 25х103 абс. ед. для пациентов, 185 ± 20х103 абс. ед. для здоровых доноров, p = 0,027, рис. 1В). Полученные результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
. Интересно, что Ковач и др. сообщили, что увеличение размера тромбоцитов характерно для пациентов, страдающих венозной тромбоэмболией
, что позволяет нам подозревать, что в нашей когорте пациентов с COVID-19 также могут наблюдаться тромботические осложнения
. Маловероятно, что наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов является характерным строго для пациентов, поражённых вирусом SARS-COV-2. Несколько недавних исследований показали, что количество тромбоцитов значительно снижается, а их размер увеличивается при пневмонии, вызванной гриппом
. Тяжелая тромбоцитопения крайне редко встречается у заражённых вирусом Эпштейна-Барра, но эта инфекция часто проявляется умеренным снижением количества тромбоцитов, а также умеренным увеличением размера тромбоцитов в лёгких случаях
.
Процент PS + тромбоцитов у пациентов был боле чем в два раза выше, чем у здоровых доноров (среднее значение ± SD: 0,74 ± 0,37% для пациентов, 0,29 ± 0,07% для здоровых доноров; p <0,0001, рис. 1D-F). Средний процент PS+ событий был выше для лактадгерина, чем для аннексина V (p = 0,0372, рис. 1E, F), что согласуется с литературными данными о более высокой чувствительности лактадгерина для идентификации фосфатидилсерина на поверхности клеток
. Значения, полученные для обоих маркеров PS+ тромбоцитов, хорошо коррелировали друг с другом (r = 0,64, p <0,0001), равно как и общий процент PS+ событий (r = 0,74, p <0,0001 для аннексина V, r = 0,96, p <0,0001 для лактадгерин, см. Таблицу 1). Таким образом, можно сделать вывод, что мы наблюдаем гиперактивацию тромбоцитов при COVID-19, что соответствует ранее опубликованным данным
[
32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
.

Известно, что PS+ тромбоциты образуются в ответ на сильную стимуляцию, например, комбинацией коллагена и тромбина

. Наблюдаемое увеличение процента PS + тромбоцитов (0,5–1,5%) у пациентов с Covid-19 может отражать постоянную активацию тромбоцитов в кровообращении
. Воспалительный процесс в организме пациента с COVID-19 неразрывно связан с активацией клеток в соседних тканях
[
12
The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

]
и может приводить к активации тромбоцитов из-за их контакта с продуктами тромбообразующих процессов (например, с содержимым тромбоцитов: гранулами, тромбином, АДФ и др.)
[
3
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
. Таким образом, в случае продолжающегося умеренного микротромбоза легких может наблюдаться слабое увеличение количества PS + тромбоцитов. Это соответствует клинической картине исследуемых пациентов, поскольку ни у одного из них не было тяжелых тромботических осложнений в ходе исследования.

. Сравнение процента прокоагулянтных тромбоцитов и их размера у пациентов с COVID-19 и здоровых доноров. A - Выделение области для прямого (FS-A) и бокового (SS-A) рассеяния света: события в красном овале соответствуют тромбоцитам, события в красном квадрате соответствуют тромбоцитам и везикулам. B - Определение доли событий, положительных для аннексина (anV +), лактадгерина (lact +) и фосфатидилсерин-положительных событий (попадающих в обе или одну из областей). C - Сравнение полученных средних размеров тромбоцитов от здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). D - Сравнение полученных значений процента фосфатидилсерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). E - Сравнение полученных значений процента аннексин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). F - Сравнение полученных значений процента лактадгерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). G - Общая информация о пациентах с COVID-19, включенных в исследование. Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; три звездочки означают p <0,001, четыре - p <0,0001.
Figure 1. . Сравнение процента прокоагулянтных тромбоцитов и их размера у пациентов с COVID-19 и здоровых доноров. A - Выделение области для прямого (FS-A) и бокового (SS-A) рассеяния света: события в красном овале соответствуют тромбоцитам, события в красном квадрате соответствуют тромбоцитам и везикулам. B - Определение доли событий, положительных для аннексина (anV +), лактадгерина (lact +) и фосфатидилсерин-положительных событий (попадающих в обе или одну из областей). C - Сравнение полученных средних размеров тромбоцитов от здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). D - Сравнение полученных значений процента фосфатидилсерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с Covid-19 (красный). E - Сравнение полученных значений процента аннексин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). F - Сравнение полученных значений процента лактадгерин-положительных событий у здоровых доноров (зеленый) и пациентов с COVID-19 (красный). G - Общая информация о пациентах с COVID-19, включенных в исследование. Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; три звездочки означают p <0,001, четыре - p <0,0001.

Корреляция параметров тромбоцитов с клинической картиной

Тромбоциты являются не только важными участниками свертывания крови, но также являются важным источником медиаторов воспаления. Помимо антикоагулянтной терапии, применяемой для терапии пациентов с COVID-19, противовоспалительная терапия также проводится с использованием различных подходов: к ним относятся иммунодепрессанты (например, актемра, тоцилизумаб), противомалярийные препараты (гидроксихлорохин) и кортикостероиды
. Поэтому нами была проанализирована корреляция между параметрами тромбоцитов, применяемой терапией и сопутствующими заболеваниями пациентов.

Доля PS + тромбоцитов коррелировала (r = 0,69, p <0,01) с повреждением легких (по данным компьютерной томографии, выполненной не позднее, чем через 2 дня от даты исследования тромбоцитов, таблица 1). Эти результаты хорошо согласуются с гипотезой о влиянии воспалительного процесса, происходящего в легких, на систему свертывания, поскольку увеличение площади пораженных альвеол приводит к активации соседних эндотелиальных тканей

[
50,
Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis

M. Schouten, W. Wiersinga, M. Levi, T. van der Poll

Journal of Leukocyte Biology. 2008, 83, 536-545

]
. Кроме того, наблюдалась отрицательная корреляция (r = -0,49, p <0,05) между общим количеством тромбоцитов и долей прокоагулянтных клеток. Мы предполагаем, что причиной этих изменений может быть высокое потребление тромбоцитов (таблица 1). Процент PS + тромбоцитов и количество тромбоцитов коррелировали с уровнем фибриногена в крови (p <0,05 и p <0,001 соответственно, таблица 1). Этот результат можно объяснить тромбообразованием, приводящим к повышенному потреблению факторов свертывания крови и тромбоцитов. Благодаря этому печень компенсирует потребление белка
[
52
Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

]
. Не было обнаружено корреляции между долей прокоагулянтных тромбоцитов и С-реактивным белком или D-димером (см. Таблицу 1).

Корреляция параметров тромбоцитов и применяемой терапии

Каждому из включённых в исследование пациентов назначалась тромбопрофилактика
[
53
ISTH interim guidance on recognition and management of coagulopathy in COVID‐19

J. Thachil, N. Tang, S. Gando, A. Falanga, M. Cattaneo, M. Levi, C. Clark, T. Iba

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1023-1026

]
. Известно, что использование гепаринов может привести к транзиторной гепарин-индуцированной тромбоцитопении (ГИТ)
[
54,
Temporal Aspects of Heparin-Induced Thrombocytopenia

T. Warkentin, J. Kelton

New England Journal of Medicine. 2001, 344, 1286-1292

55
Heparin-Induced Thrombocytopenia in Patients Treated with Low-Molecular-Weight Heparin or Unfractionated Heparin

T. Warkentin, M. Levine, J. Hirsh, P. Horsewood, R. Roberts, M. Gent, J. Kelton

New England Journal of Medicine. 1995, 332, 1330-1336

]
. Однако в нашем исследовании этого не наблюдалось. Количество PS + тромбоцитов у пациентов, получавших гепарины, также не отличалось по сравнению с другими пациентами с COVID-19 (рис. 2A). Иногда пациентам с COVID-19 также назначают антиагрегантные препараты
. У двух из трех пациентов, получавших антитромбоцитарные препараты до госпитализации в связи с коронавирусной инфекцией, количество PS + тромбоцитов было значительно ниже, чем у других пациентов с COVID-19 (рис. 2A).
Согласно ранее опубликованным рекомендациям, пациентам в больнице назначают другие терапевтические средства, в том числе антиретровирусный препарат лопинавир
[
57,
Treatment With Lopinavir/Ritonavir or Interferon-β1b Improves Outcome of MERS-CoV Infection in a Nonhuman Primate Model of Common Marmoset

J. Chan, Y. Yao, M. Yeung, W. Deng, L. Bao, L. Jia, F. Li, C. Xiao, H. Gao, P. Yu, J. Cai, H. Chu, J. Zhou, H. Chen, C. Qin, K. Yuen

Journal of Infectious Diseases. 2015, 212, 1904-1913

58
Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir–ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial

I. Hung, K. Lung, E. Tso, R. Liu, T. Chung, M. Chu, Y. Ng, J. Lo, J. Chan, A. Tam, H. Shum, V. Chan, A. Wu, K. Sin, W. Leung, W. Law, D. Lung, S. Sin, P. Yeung, C. Yip, R. Zhang, A. Fung, E. Yan, K. Leung, J. Ip, A. Chu, W. Chan, A. Ng, R. Lee, K. Fung, A. Yeung, T. Wu, J. Chan, W. Yan, W. Chan, J. Chan, A. Lie, O. Tsang, V. Cheng, T. Que, C. Lau, K. Chan, K. To, K. Yuen

The Lancet. 2020, 395, 1695-1704

]
. Различий в количестве прокоагулянтных тромбоцитов между группами пациентов, которые принимали и не принимали комбинацию лопинавир-ритонавир не было обнаружено (рис. 2А).

При сравнении групп пациентов на наличие хронических заболеваний статистически значимые различия (p = 0,027) выявлены только для группы пациентов с хроническими заболеваниями легких. Процент событий PS + при наличии заболевания был ниже, чем при отсутствии (среднее значение ± стандартное отклонение: 0,81 ± 0,37% для отсутствия, 0,41 ± 0,17% для присутствия, рис. 2B), что может быть связано с наличием компенсаторный механизм в системе свертывания крови этих пациентов. Когорта пациентов, включенных в это исследование, весьма неоднородна с точки зрения возраста и состояния здоровья. Однако отсутствие значимых различий между разными группами пациентов (рис. 2B, рис. S1) и отсутствие наблюдаемого измененного фенотипа тромбоцитов при хронических заболеваниях

[
59,
Small procoagulant platelets in diabetes type 2

M. Edvardsson, M. Oweling, P. Järemo

Thrombosis Research. 2020, 195, 1-7

60,
Coagulation testing and management in liver disease patients

M. Stotts, J. Davis, N. Shah

Current Opinion in Gastroenterology. 2020, 36, 169-176

61,
Platelet and coagulation disorders in newly diagnosed patients with pulmonary arterial hypertension

E. Vrigkou, I. Tsangaris, S. Bonovas, P. Kopterides, E. Kyriakou, D. Konstantonis, A. Pappas, A. Anthi, A. Gialeraki, S. Orfanos, A. Armaganidis, A. Tsantes

Platelets. 2019, 30, 646-651

]
позволяет нам утверждать, что данный фенотип сформировался именно по причине COVID-19.

Связь положительных по фосфатидилсерину событий с клиническими параметрами пациентов, наличием хронических заболеваний и проводимой терапией.A - Сравнение результатов пациентов на терапии, которую они принимают (3 разные группы по количеству низкомолекулярных гепаринов; группа, принимавшая антикоагулянты и антиагреганты; группа, принимавшая препараты против ВИЧ, и не принимавшая их). При использовании статистики критерия Манна-Уитни достоверных различий между группами не обнаружено. B - Сравнение процента фосфатидилсерин-положительных событий для групп пациентов, страдающих различными хроническими заболеваниями (сахарный диабет II типа (Diabetes), заболевания желудочно-кишечного тракта (Digestive), легких (Lungs), сердечно-сосудистые (Cardiovascular), хроническая артериальная гипертензия (CAH)). Зеленый прямоугольник показывает нормальный диапазон, полученный для здоровых доноров (среднее ± 2 стандартных отклонения). Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; одна звездочка означает p <0,05.
Figure 2. Связь положительных по фосфатидилсерину событий с клиническими параметрами пациентов, наличием хронических заболеваний и проводимой терапией.A - Сравнение результатов пациентов на терапии, которую они принимают (3 разные группы по количеству низкомолекулярных гепаринов; группа, принимавшая антикоагулянты и антиагреганты; группа, принимавшая препараты против ВИЧ, и не принимавшая их). При использовании статистики критерия Манна-Уитни достоверных различий между группами не обнаружено. B - Сравнение процента фосфатидилсерин-положительных событий для групп пациентов, страдающих различными хроническими заболеваниями (сахарный диабет II типа (Diabetes), заболевания желудочно-кишечного тракта (Digestive), легких (Lungs), сердечно-сосудистые (Cardiovascular), хроническая артериальная гипертензия (CAH)). Зеленый прямоугольник показывает нормальный диапазон, полученный для здоровых доноров (среднее ± 2 стандартных отклонения). Для определения значимости использовался критерий Манна-Уитни; одна звездочка означает p <0,05.

Компьютерная модель предсказывает, что в основе тромбоцитопатии COVID-19 лежит усиленное потребление тромбоцитов

Фенотип тромбоцитов у пациентов с COVID-19 оказался достаточно характерным: в то время как ни в литературе, ни в нашем исследовании не было обнаружено значительной тромбоцитопении
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

29,
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
, наблюдалось одновременное увеличение размера тромбоцитов и доли PS + тромбоцитов. Чтобы понять, может ли такой фенотип быть вызван потреблением тромбоцитов из-за тромбоза, мы построили модель продукции, старения и клиренса тромбоцитов (рис. 3А).
В модели, в отсутствие дополнительного потребления тромбоцитов, среднее количество тромбоцитов составило от 155 × 103 тромбоцитов / мкл до 177 × 103 тромбоцитов / мкл (рис. 3B). Количество тромбоцитов и размер тромбоцитов стохастически колебались (рис. S2 A и B, соответственно). Введение дополнительного потребления, не влиявшего значительно на количество тромбоцитов (∆Plt <25 000 / мкл), привело к значительному увеличению размера тромбоцитов (рис. 3B, C; S2A, B). Повышенное потребление также привело к «омоложению» тромбоцитов (рис. S2C, D). Увеличение потребления тромбоцитов выше 2 привело к легкой тромбоцитопении и ещё более выраженному снижению среднего возраста тромбоцитов (рис. 3B). Тяжелая тромбоцитопения появлялась при потреблении тромбоцитов выше K = 5, что соответствовало потреблению более половины произведенных тромбоцитов (рис. 3B, S2). Дополнительный анализ чувствительности показал, что результаты модели были наиболее чувствительны к параметрам синтеза ТПО, потребления тромбоцитов и клиренса тромбоцитов. Эти реакции выделены красным цветом (рис. 3А).

Примечательно, что доля PS+ тромбоцитов слабо коррелировала со средними значениями FS-A (таблица 1). Этот вывод подтверждает гипотезу о том, что при COVID-19 тромбоциты потребляются из-за тромбоза, что приводит к увеличению фракции PS + тромбоцитов, снижению среднего возраста тромбоцитов и, следовательно, увеличению их размера. Слабость корреляции может быть вызвана повышенным клиренсом PS+ тромбоцитов печенью и селезенкой

. Однако следует также иметь в виду, что клетки во время эксперимента находились в состоянии покоя, и сравнение степени активации для пациентов и здоровых доноров не проводилось.

Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.
Figure 3. Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.

Заключение

В рамках данной работы мы наблюдали значительное увеличение доли PS+ тромбоцитов у пациентов с COVID-19 (рис. 1). Это явление не коррелирует ни с терапевтическими вмешательствами, проводимыми в стационаре, ни с хроническими заболеваниями пациентов (рис. 2). Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов и экспозиция фосфатидилсерина, в основном, вызваны COVID-19 и связанной с ним пневмонией. Ранее сообщалось, что такие изменения могут быть вызваны активным тромбозом
[
26,
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

]
. Предлагаемая вычислительная модель демонстрирует, что умеренное потребление, которое не приводит к выраженной тромбоцитопении, может привести к увеличению среднего объема тромбоцитов в 1,3 раза, наблюдаемому у пациентов с COVID-19 (рис. 1).
Основываясь на наших экспериментальных результатах и теоретических выводах, мы предлагаем следующую схему воздействия COVID-19 на тромбоциты человека:
•     SARS-CoV-2 вызывает повреждение легких. Это приводит к активации эндотелия кровеносных сосудов и выставлению тканевого фактора (ТФ) в кровоток
[
12,
The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

13
Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

]
;
•     ТФ вызывает тромбообразование и потребление тромбоцитов;
•     Доля PS+ тромбоцитов увеличивается (рис. 1) в результате сильной активации тромбоцитов, а продукция тромбоцитов увеличивается за счет мегакариоцитов (рис. 3)
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

29,
Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

32
Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

]
из-за увеличения синтеза ТПО печенью
[
3
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
;
•     Происходит легкое снижение количества тромбоцитов
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

52
Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

]
, в то время как размер тромбоцитов значительно увеличивается
[
3,
Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

Blood. 2020, 136, 1317-1329

]
.

Таким образом, можно предположить, что терапевтическая коррекция протромбогенного состояния эндотелия сосудов легких может улучшить качество тромбоцитов. Тем не менее, необходимо дальнейшее изучение тромбоцитов и их роли в развитии COVID-19, поскольку тромбоциты потенциально можно использовать для мониторинга системы гемостаза у пациентов с COVID-19.

Вклад авторов

S.M.G. проводила эксперименты, обрабатывала клинические и экспериментальные данные и писала текст статьи, M.A.A. разрабатывал модель, обрабатывал данные моделирования, проводил эксперименты и редактировал текст статьи, A.O.I. обрабатывала клинические данные, B.A.E. обрабатывала экспериментальные данные, R.S.A. и R.A.G. планировали проект и обрабатывали клинические данные, P.M.A. и A.F.I. планировали и курировали проект, S.A.N. планировала и курировала проект, обрабатывала данные, разрабатывала модель и писала текст статьи. Все авторы предоставляли критическую оценку и помогали сформировать исследование, анализ и рукопись.

Финансирование

Работа была поддержана Стипендией Президента СП-2675.2019.4; грантом эндаунмент фонда “Наука - детям” и Школой Цифровой Медицины Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Библиографические ссылки статьи:

  1. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia

    Q. Li, X. Guan, P. Wu, X. Wang, L. Zhou, Y. Tong, R. Ren, K. Leung, E. Lau, J. Wong, X. Xing, N. Xiang, Y. Wu, C. Li, Q. Chen, D. Li, T. Liu, J. Zhao, M. Liu, W. Tu, C. Chen, L. Jin, R. Yang, Q. Wang, S. Zhou, R. Wang, H. Liu, Y. Luo, Y. Liu, G. Shao, H. Li, Z. Tao, Y. Yang, Z. Deng, B. Liu, Z. Ma, Y. Zhang, G. Shi, T. Lam, J. Wu, G. Gao, B. Cowling, B. Yang, G. Leung, Z. Feng

    New England Journal of Medicine. 2020, 382, 1199-1207

  2. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China

    C. Huang, Y. Wang, X. Li, L. Ren, J. Zhao, Y. Hu, L. Zhang, G. Fan, J. Xu, X. Gu, Z. Cheng, T. Yu, J. Xia, Y. Wei, W. Wu, X. Xie, W. Yin, H. Li, M. Liu, Y. Xiao, H. Gao, L. Guo, J. Xie, G. Wang, R. Jiang, Z. Gao, Q. Jin, J. Wang, B. Cao

    The Lancet. 2020, 395, 497-506

  3. Platelet gene expression and function in patients with COVID-19

    B. Manne, F. Denorme, E. Middleton, I. Portier, J. Rowley, C. Stubben, A. Petrey, N. Tolley, L. Guo, M. Cody, A. Weyrich, C. Yost, M. Rondina, R. Campbell

    Blood. 2020, 136, 1317-1329

  4. Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

    X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

  5. Thrombocytopenia is associated with severe coronavirus disease 2019 (COVID-19) infections: A meta-analysis

    G. Lippi, M. Plebani, B. Henry

    Clinica Chimica Acta. 2020, 506, 145-148

  6. Platelets in COVID-19: “innocent by-standers” or active participants?

    O. An, A. Martyanov, M. Stepanyan, A. Boldova, S. Rumyantsev, M. Panteleev, F. Ataullakhanov, A. Rumyantsev, A. Sveshnikova

    Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. , 20, 184-191

  7. The pathogenesis and treatment of the `Cytokine Storm' in COVID-19

    Q. Ye, B. Wang, J. Mao

    Journal of Infection. 2020, 80, 607-613

  8. Hematological findings and complications of COVID ‐19

    E. Terpos, I. Ntanasis‐Stathopoulos, I. Elalamy, E. Kastritis, T. Sergentanis, M. Politou, T. Psaltopoulou, G. Gerotziafas, M. Dimopoulos

    American Journal of Hematology. 2020, 95, 834-847

  9. Hypercoagulability of COVID‐19 patients in intensive care unit: A report of thromboelastography findings and other parameters of hemostasis

    M. Panigada, N. Bottino, P. Tagliabue, G. Grasselli, C. Novembrino, V. Chantarangkul, A. Pesenti, F. Peyvandi, A. Tripodi

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1738-1742

  10. Anticoagulant treatment is associated with decreased mortality in severe coronavirus disease 2019 patients with coagulopathy

    N. Tang, H. Bai, X. Chen, J. Gong, D. Li, Z. Sun

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1094-1099

  11. Incidence of thrombotic complications in critically ill ICU patients with COVID-19

    F. Klok, M. Kruip, N. van der Meer, M. Arbous, D. Gommers, K. Kant, F. Kaptein, J. van Paassen, M. Stals, M. Huisman, H. Endeman

    Thrombosis Research. 2020, 191, 145-147

  12. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention

    M. Tay, C. Poh, L. Rénia, P. MacAry, L. Ng

    Nature Reviews Immunology. 2020, 20, 363-374

  13. Leukocyte trafficking to the lungs and beyond: lessons from influenza for COVID-19

    R. Alon, M. Sportiello, S. Kozlovski, A. Kumar, E. Reilly, A. Zarbock, N. Garbi, D. Topham

    Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 49-64

  14. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19

    A. Bonaventura, A. Vecchié, L. Dagna, K. Martinod, D. Dixon, B. Van Tassell, F. Dentali, F. Montecucco, S. Massberg, M. Levi, A. Abbate

    Nature Reviews Immunology. 2021, 21, 319-329

  15. Tissue factor as a link between inflammation and coagulation

    M. Witkowski, U. Landmesser, U. Rauch

    Trends in Cardiovascular Medicine. 2016, 26, 297-303

  16. von Willebrand Factor and Platelet Glycoprotein Ib: A Thromboinflammatory Axis in Stroke

    F. Denorme, K. Vanhoorelbeke, S. De Meyer

    Frontiers in Immunology. , 10, 2884

  17. Heparin and Low-Molecular-Weight Heparin Mechanisms of Action, Pharmacokinetics, Dosing, Monitoring, Efficacy, and Safety

    J. Hirsh, T. Warkentin, S. Shaughnessy, S. Anand, J. Halperin, R. Raschke, C. Granger, E. Ohman, J. Dalen

    Chest. 2001, 119, 64S-94S

  18. COVID-19 and its implications for thrombosis and anticoagulation

    J. Connors, J. Levy

    Blood. 2020, 135, 2033-2040

  19. Higher heparin dosages reduce thromboembolic complications in patients with COVID-19 pneumonia

    C. Carallo, F. Pugliese, E. Vettorato, C. Tripolino, L. Delle Donne, G. Guarrera, W. Spagnolli, S. Cozzio

    Journal of Investigative Medicine. 2021, 69, 884-887

  20. Risk of Clinically Relevant Venous Thromboembolism in Critically Ill Patients With COVID-19: A Systematic Review and Meta-Analysis

    J. Gratz, M. Wiegele, M. Maleczek, H. Herkner, H. Schöchl, E. Chwala, P. Knöbl, E. Schaden

    Frontiers in Medicine. 2021, 8,

  21. Is Acetylsalicylic Acid a Safe and Potentially Useful Choice for Adult Patients with COVID-19 ?

    V. Bianconi, F. Violi, F. Fallarino, P. Pignatelli, A. Sahebkar, M. Pirro

    Drugs. 2020, 80, 1383-1396

  22. Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

    A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

  23. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

    N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Blood. 2016, 128, 1745-1755

  24. Flow cytometry for pediatric platelets

    A. Ignatova, E. Ponomarenko, D. Polokhov, E. Suntsova, P. Zharkov, D. Fedorova, E. Balashova, A. Rudneva, V. Ptushkin, E. Nikitin, A. Shcherbina, A. Maschan, G. Novichkova, M. Panteleev

    Platelets. 2019, 30, 428-437

  25. New Fundamentals in Hemostasis

    H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

    Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

  26. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

    D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

  27. Platelet Apoptosis and Apoptotic Platelet Clearance by Macrophages in Secondary Dengue Virus Infections

    M. Alonzo, T. Lacuesta, E. Dimaano, T. Kurosu, L. Suarez, C. Mapua, Y. Akeda, R. Matias, D. Kuter, S. Nagata, F. Natividad, K. Oishi

    The Journal of Infectious Diseases. 2012, 205, 1321-1329

  28. The Impact of COVID-19 Disease on Platelets and Coagulation

    G. Wool, J. Miller

    Pathobiology. 2021, 88, 15-27

  29. Platelets Can Associate With SARS-CoV-2 RNA and Are Hyperactivated in COVID-19

    Y. Zaid, F. Puhm, I. Allaeys, A. Naya, M. Oudghiri, L. Khalki, Y. Limami, N. Zaid, K. Sadki, R. Ben El Haj, W. Mahir, L. Belayachi, B. Belefquih, A. Benouda, A. Cheikh, M. Langlois, Y. Cherrah, L. Flamand, F. Guessous, E. Boilard

    Circulation Research. 2020, 127, 1404-1418

  30. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways

    J. Burkhart, M. Vaudel, S. Gambaryan, S. Radau, U. Walter, L. Martens, J. Geiger, A. Sickmann, R. Zahedi

    Blood. 2012, 120, e73-e82

  31. SARS-CoV-2 binds platelet ACE2 to enhance thrombosis in COVID-19

    S. Zhang, Y. Liu, X. Wang, L. Yang, H. Li, Y. Wang, M. Liu, X. Zhao, Y. Xie, Y. Yang, S. Zhang, Z. Fan, J. Dong, Z. Yuan, Z. Ding, Y. Zhang, L. Hu

    Journal of Hematology & Oncology. 2020, 13,

  32. Platelets Promote Thromboinflammation in SARS-CoV-2 Pneumonia

    F. Taus, G. Salvagno, S. Canè, C. Fava, F. Mazzaferri, E. Carrara, V. Petrova, R. Barouni, F. Dima, A. Dalbeni, S. Romano, G. Poli, M. Benati, S. De Nitto, G. Mansueto, M. Iezzi, E. Tacconelli, G. Lippi, V. Bronte, P. Minuz

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2975-2989

  33. Cellular automata as models of complexity

    S. Wolfram

    Nature. 1984, 311, 419-424

  34. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets

    S. Patel

    Journal of Clinical Investigation. 2005, 115, 3348-3354

  35. Thrombopoietin levels in patients with disorders of platelet production: Diagnostic potential and utility in predicting response to TPO Receptor agonists

    R. Makar, O. Zhukov, M. Sahud, D. Kuter

    American Journal of Hematology. 2013, 88, 1041-1044

  36. Platelet clearance by the hepatic Ashwell-Morrell receptor: mechanisms and biological significance

    K. Hoffmeister, H. Falet

    Thrombosis Research. 2016, 141, S68-S72

  37. Platelet reticulated forms, size indexes, and functional activity. Interactions in healthy volunteers

    V. V. Bodrova, O. N. Shustova, S. G. Khaspekova, and A. V. Mazurov

    Platelets. 2021, , 1-6

  38. Ultrastructural, transcriptional, and functional differences between human reticulated and non‐reticulated platelets

    L. Hille, M. Lenz, A. Vlachos, B. Grüning, L. Hein, F. Neumann, T. Nührenberg, D. Trenk

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 2034-2046

  39. Investigation of the efficacy and safety of eltrombopag to correct thrombocytopenia in moderate to severe dengue patients - a phase II randomized controlled clinical trial

    S. Chakraborty, S. Alam, M. Sayem, M. Sanyal, T. Das, P. Saha, M. Sayem, B. Byapari, C. Tabassum, A. Kabir, M. Amin, A. Nabi

    EClinicalMedicine. 2020, 29-30, 100624

  40. Mean Platelet Volume and Immature Platelet Fraction in Autoimmune Disorders

    D. Schmoeller, M. Picarelli, T. Paz Munhoz, C. Poli de Figueiredo, H. Staub

    Frontiers in Medicine. 2017, 4,

  41. Characteristics of platelet count and size and diagnostic accuracy of mean platelet volume in patients with venous thromboembolism. A systematic review and meta-analysis

    S. Kovács, Z. Csiki, K. Zsóri, Z. Bereczky, A. Shemirani

    Platelets. 2019, 30, 139-147

  42. Anatomical and Pathological Observation and Analysis of SARS and COVID-19: Microthrombosis Is the Main Cause of Death

    W. Chen, J. Pan

    Biological Procedures Online. 2021, 23,

  43. Difference of coagulation features between severe pneumonia induced by SARS-CoV2 and non-SARS-CoV2

    S. Yin, M. Huang, D. Li, N. Tang

    Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2021, 51, 1107-1110

  44. The value of the platelet count and platelet indices in differentiation of COVID‐19 and influenza pneumonia

    N. Ozcelik, S. Ozyurt, B. Yilmaz Kara, A. Gumus, U. Sahin

    Journal of Medical Virology. 2021, 93, 2221-2226

  45. Severe thrombocytopenia as a complication of acute Epstein-Barr virus infection

    R. Likic, D. Kuzmanic

    Wiener Klinische Wochenschrift. 2004, 116, 47-50

  46. Measurement of phosphatidylserine exposure during storage of platelet concentrates using the novel probe lactadherin: a comparison study with annexin V

    A. Albanyan, M. Murphy, J. Rasmussen, C. Heegaard, P. Harrison

    Transfusion. 2009, 49, 99-107

  47. Procoagulant Platelets: Mechanisms of Generation and Action

    N. Podoplelova, D. Nechipurenko, A. Ignatova, A. Sveshnikova, M. Panteleev

    Hämostaseologie. 2021, 41, 146-153

  48. Collagen But Not Fibrinogen Surfaces Induce Bleb Formation, Exposure of Phosphatidylserine, and Procoagulant Activity of Adherent Platelets: Evidence for Regulation by Protein Tyrosine Kinase-Dependent Ca2+ Responses

    J. Heemskerk, W. Vuist, M. Feijge, C. Reutelingsperger, T. Lindhout

    Blood. 1997, 90, 2615-2625

  49. Coated-Platelets Improve Prediction of Stroke and Transient Ischemic Attack in Asymptomatic Internal Carotid Artery Stenosis

    A. Kirkpatrick, A. Tafur, A. Vincent, G. Dale, C. Prodan

    Stroke. 2014, 45, 2995-3001

  50. Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis

    M. Schouten, W. Wiersinga, M. Levi, T. van der Poll

    Journal of Leukocyte Biology. 2008, 83, 536-545

  51. The lung microvascular endothelium as a therapeutic target in severe influenza

    S. Armstrong, S. Mubareka, W. Lee

    Antiviral Research. 2013, 99, 113-118

  52. Thrombocytopenia and its association with mortality in patients with COVID‐19

    X. Yang, Q. Yang, Y. Wang, Y. Wu, J. Xu, Y. Yu, Y. Shang

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1469-1472

  53. ISTH interim guidance on recognition and management of coagulopathy in COVID‐19

    J. Thachil, N. Tang, S. Gando, A. Falanga, M. Cattaneo, M. Levi, C. Clark, T. Iba

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2020, 18, 1023-1026

  54. Temporal Aspects of Heparin-Induced Thrombocytopenia

    T. Warkentin, J. Kelton

    New England Journal of Medicine. 2001, 344, 1286-1292

  55. Heparin-Induced Thrombocytopenia in Patients Treated with Low-Molecular-Weight Heparin or Unfractionated Heparin

    T. Warkentin, M. Levine, J. Hirsh, P. Horsewood, R. Roberts, M. Gent, J. Kelton

    New England Journal of Medicine. 1995, 332, 1330-1336

  56. Use of antiplatelet drugs and the risk of mortality in patients with COVID-19: a meta‐analysis

    C. S. Kow and S. S. Hasan

    Journal of Thrombosis and Thrombolysis. 2021, ,

  57. Treatment With Lopinavir/Ritonavir or Interferon-β1b Improves Outcome of MERS-CoV Infection in a Nonhuman Primate Model of Common Marmoset

    J. Chan, Y. Yao, M. Yeung, W. Deng, L. Bao, L. Jia, F. Li, C. Xiao, H. Gao, P. Yu, J. Cai, H. Chu, J. Zhou, H. Chen, C. Qin, K. Yuen

    Journal of Infectious Diseases. 2015, 212, 1904-1913

  58. Triple combination of interferon beta-1b, lopinavir–ritonavir, and ribavirin in the treatment of patients admitted to hospital with COVID-19: an open-label, randomised, phase 2 trial

    I. Hung, K. Lung, E. Tso, R. Liu, T. Chung, M. Chu, Y. Ng, J. Lo, J. Chan, A. Tam, H. Shum, V. Chan, A. Wu, K. Sin, W. Leung, W. Law, D. Lung, S. Sin, P. Yeung, C. Yip, R. Zhang, A. Fung, E. Yan, K. Leung, J. Ip, A. Chu, W. Chan, A. Ng, R. Lee, K. Fung, A. Yeung, T. Wu, J. Chan, W. Yan, W. Chan, J. Chan, A. Lie, O. Tsang, V. Cheng, T. Que, C. Lau, K. Chan, K. To, K. Yuen

    The Lancet. 2020, 395, 1695-1704

  59. Small procoagulant platelets in diabetes type 2

    M. Edvardsson, M. Oweling, P. Järemo

    Thrombosis Research. 2020, 195, 1-7

  60. Coagulation testing and management in liver disease patients

    M. Stotts, J. Davis, N. Shah

    Current Opinion in Gastroenterology. 2020, 36, 169-176

  61. Platelet and coagulation disorders in newly diagnosed patients with pulmonary arterial hypertension

    E. Vrigkou, I. Tsangaris, S. Bonovas, P. Kopterides, E. Kyriakou, D. Konstantonis, A. Pappas, A. Anthi, A. Gialeraki, S. Orfanos, A. Armaganidis, A. Tsantes

    Platelets. 2019, 30, 646-651

  62. Levels of procoagulant microvesicles are elevated after traumatic injury and platelet microvesicles are negatively correlated with mortality

    N. Curry, A. Raja, J. Beavis, S. Stanworth, P. Harrison

    Journal of Extracellular Vesicles. 2014, 3, 25625