Русский
Русский
English
Open access Клеточные системы

Фосфотидилинозитол-содержащие везикулы необходимы для активации PLC ζ в соответствие с предсказанием математической модели

Алексей Табачник1
Алексей Табачник
Алексей Табачник
Адрес для переписки:[email protected]
1
Физический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Информация на Google Scholar
1.
Физический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Введение

При оплодотворении млекопитающих сперма вызывает серию колебаний кальция в яйцеклетке, которые вызывают активацию яйцеклетки и раннее эмбриональное развитие
[
1
Essential Role of Sperm-Specific PLC-Zeta in Egg Activation and Male Factor Infertility: An Update

A. Saleh, J. Kashir, A. Thanassoulas, B. Safieh-Garabedian, F. Lai, M. Nomikos

Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2020, 8, None

https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00028

Article | Google Scholar

]
. Фосфолипаза C (PLC) ζ — это специфичный для сперматозоидов белок, способный вызывать высвобождение Ca2+ из внутриклеточных хранилищ
[
2
Broad, ectopic expression of the sperm protein PLCZ1 induces parthenogenesis and ovarian tumours in mice

N. Yoshida, M. Amanai, T. Fukui, E. Kajikawa, M. Brahmajosyula, A. Iwahori, Y. Nakano, S. Shoji, J. Diebold, H. Hessel, R. Huss, A. Perry

Development. 2007, 134, 3941-3952

https://doi.org/10.1242/dev.007930

Article | Google Scholar

]
. PLCζ — это фермент, который катализирует реакцию гидролиза фосфатидилинозитол-4,5-фосфата (PIP2) на инозитол-3-фосфат (IP3) и диацилглицерол (DAG). Он присутствует в акросоме и цитозоле сперматозоидов, но не оказывает значительного влияния на их метаболизм. Однако после слияния сперматозоидов и яйцеклетки его активность увеличивается, поскольку PLCζ начинает связывать мембраны яйцеклетки и генерировать IP3
[
3
Phospholipase C zeta and calcium oscillations at fertilisation: The evidence, applications, and further questions

J. Kashir, M. Nomikos, F. Lai

Advances in Biological Regulation. 2018, 67, 148-162

https://doi.org/10.1016/j.jbior.2017.10.012

Article | Google Scholar

]
. PLCζ может также инициировать колебания кальция в ооцитах без сперматозоидов, если его экспрессия в ооците искусственно активирована
[
2
Broad, ectopic expression of the sperm protein PLCZ1 induces parthenogenesis and ovarian tumours in mice

N. Yoshida, M. Amanai, T. Fukui, E. Kajikawa, M. Brahmajosyula, A. Iwahori, Y. Nakano, S. Shoji, J. Diebold, H. Hessel, R. Huss, A. Perry

Development. 2007, 134, 3941-3952

https://doi.org/10.1242/dev.007930

Article | Google Scholar

]
. Некоторые яйцеклетки, оплодотворенные PLCζ-нулевой спермой, могут развиваться, хотя и со значительно меньшей эффективностью и после значительной временной задержки
[
4
PLCζ is the physiological trigger of the Ca2+ oscillations that induce embryogenesis in mammals but offspring can be conceived in its absence.

Hachem A, Godwin J, Ruas M, Lee HC, Buitrago MF, Ardestani G, et al.

Development. 2017, None, None

https://doi.org/10.1242/dev.150227

Article | Google Scholar

]
.
Один из основных вопросов о PLCζ - причина отсутствия его активности в сперматозоидах и клетках других типов, таких как клетки яичников китайского хомячка (CHO)
[
5
Divergent effect of mammalian PLCζ in generating Ca2+ oscillations in somatic cells compared with eggs

S. Phillips, Y. Yu, A. Rossbach, M. Nomikos, V. Vassilakopoulou, E. Livaniou, B. Cumbes, F. Lai, C. George, K. Swann

Biochemical Journal. 2011, 438, 545-553

https://doi.org/10.1042/BJ20101581

Article | Google Scholar

]
. Несколько гипотез объясняют причину активности PLCζ исключительно в ооцитах (рис. 1). Одна из них предполагает наличие неизвестного кофактора, активирующего PLCζ (рис. 1А). Этот кофактор может находится в цитозоле ооцита
[
3
Phospholipase C zeta and calcium oscillations at fertilisation: The evidence, applications, and further questions

J. Kashir, M. Nomikos, F. Lai

Advances in Biological Regulation. 2018, 67, 148-162

https://doi.org/10.1016/j.jbior.2017.10.012

Article | Google Scholar

]
. Альтернативное объяснение предполагает, что в сперматозоиде PLCζ связана с каким-то ингибитором (рис. 1B), и после слияния с ооцитом комплекс с ингибитором растворяется. Эта гипотеза частично противоречит данным
[
5
Divergent effect of mammalian PLCζ in generating Ca2+ oscillations in somatic cells compared with eggs

S. Phillips, Y. Yu, A. Rossbach, M. Nomikos, V. Vassilakopoulou, E. Livaniou, B. Cumbes, F. Lai, C. George, K. Swann

Biochemical Journal. 2011, 438, 545-553

https://doi.org/10.1042/BJ20101581

Article | Google Scholar

]
, где продемонстрировано, что при экспрессии в клетках яичников китайского хомячка PLCζ не оказывает значительного влияния на концентрацию кальция. Ни одна из этих гипотез не подтверждается прямыми доказательствами.
Альтернативная гипотеза основана на наличии везикул, богатых PIP2, в ооцитах (Fig. 1C, D). Эти везикулы имеют гораздо большее относительное поверхностное пространство, нежели мембрана, и было продемонстрировано, что большая часть PLCζ связывается с этими везикулами
[
5,
Divergent effect of mammalian PLCζ in generating Ca2+ oscillations in somatic cells compared with eggs

S. Phillips, Y. Yu, A. Rossbach, M. Nomikos, V. Vassilakopoulou, E. Livaniou, B. Cumbes, F. Lai, C. George, K. Swann

Biochemical Journal. 2011, 438, 545-553

https://doi.org/10.1042/BJ20101581

Article | Google Scholar

6
Starting a new life: Sperm PLC-zeta mobilizes the Ca2+ signal that induces egg activation and embryo development

M. Nomikos, K. Swann, F. Lai

BioEssays. 2012, 34, 126-134

https://doi.org/10.1002/bies.201100127

Article | Google Scholar

]
.
Ранее с помощью компьютерного моделирования был успешно показан механизм инициации кальциевой сигнализации как в сперматозоидах, так и в яйцеклетках
[
7,
A single-pool model for intracellular calcium oscillations and waves in the Xenopus laevis oocyte

A. Atri, J. Amundson, D. Clapham, J. Sneyd

Biophysical Journal. 1993, 65, 1727-1739

https://doi.org/10.1016/S0006-3495(93)81191-3

Article | Google Scholar

8
A Model for the Acrosome Reaction in Mammalian Sperm

J. Simons, L. Fauci

Bulletin of Mathematical Biology. 2018, 80, 2481-2501

https://doi.org/10.1007/s11538-018-0478-3

Article | Google Scholar

]
, однако работы по регуляции активности PLCζ отсутствуют. В этой работе математическое моделирование будет использовано для исследования механизмов регуляции активности PLCζ в сперматозоидах и яйцеклетках.
Основные гипотезы, объясняющие активность PLC ζ в ооците. (А) Первая гипотеза состоит в том, что PL ζ приобретает способность расщеплять мембранный PIP2 ооцита (〖PIP2〗 _m) и продуцировать IP3 при активации неопределенным активатором присутствующим в ооцитах. (B) Вторая гипотеза: наличие неуточненного ингибитора PLC ζ во всех типах клеток, кроме яиц (C, D). Третья гипотеза предполагает, что ооциты млекопитающих содержат везикулы с более высоким содержанием PIP2 (〖PIP2〗 _v), а PLC ζ направляется на поверхность этих везикул.
Figure 1. Основные гипотезы, объясняющие активность PLC ζ в ооците. (А) Первая гипотеза состоит в том, что PL ζ приобретает способность расщеплять мембранный PIP2 ооцита (〖PIP2〗 _m) и продуцировать IP3 при активации неопределенным активатором присутствующим в ооцитах. (B) Вторая гипотеза: наличие неуточненного ингибитора PLC ζ во всех типах клеток, кроме яиц (C, D). Третья гипотеза предполагает, что ооциты млекопитающих содержат везикулы с более высоким содержанием PIP2 (〖PIP2〗 _v), а PLC ζ направляется на поверхность этих везикул.

Материалы и методы

Построение и интегрирование компьютерной модели

Для изучения активности PLCζ в яйцах млекопитающих была разработана компьютерная модель. Сначала были построены обыкновенные дифференциальные уравнения на основе законов химической кинетики (закона действия масс, кинетики Генри-Михаэлиса-Ментен, уравнения Хилла). Параметры кинетического уравнения были взяты из литературы или оценены на основе имеющихся экспериментальных данных. Окончательная модель состояла из 18 уравнений с двумя неизвестными параметрами. Модель решалась методом LSODA.

Результаты и обсуждение

Математическая модель активности PLCζ

Прежде чем проверять вышеописанные гипотезы была разработана математическая модель активации PLCζ, способная описать существующие экспериментальные данные
[
6,
Starting a new life: Sperm PLC-zeta mobilizes the Ca2+ signal that induces egg activation and embryo development

M. Nomikos, K. Swann, F. Lai

BioEssays. 2012, 34, 126-134

https://doi.org/10.1002/bies.201100127

Article | Google Scholar

9
Human PLC  exhibits superior fertilization potency over mouse PLC  in triggering the Ca2+ oscillations required for mammalian oocyte activation

M. Nomikos, M. Theodoridou, K. Elgmati, D. Parthimos, B. Calver, L. Buntwal, G. Nounesis, K. Swann, F. Lai

Molecular Human Reproduction. 2014, 20, 489-498

https://doi.org/10.1093/molehr/gau011

Article | Google Scholar

]
. По мнению многих авторов (
[
6,
Starting a new life: Sperm PLC-zeta mobilizes the Ca2+ signal that induces egg activation and embryo development

M. Nomikos, K. Swann, F. Lai

BioEssays. 2012, 34, 126-134

https://doi.org/10.1002/bies.201100127

Article | Google Scholar

9
Human PLC  exhibits superior fertilization potency over mouse PLC  in triggering the Ca2+ oscillations required for mammalian oocyte activation

M. Nomikos, M. Theodoridou, K. Elgmati, D. Parthimos, B. Calver, L. Buntwal, G. Nounesis, K. Swann, F. Lai

Molecular Human Reproduction. 2014, 20, 489-498

https://doi.org/10.1093/molehr/gau011

Article | Google Scholar

]
), уникальной особенностью PLCζ является его высокая кооперативность для связывания Ca2+, которая осуществляется её четырьмя EF-доменами. Коэффициент Хилла для данного белка варьируется от 3.8 до 4.3 (
[
5,
Divergent effect of mammalian PLCζ in generating Ca2+ oscillations in somatic cells compared with eggs

S. Phillips, Y. Yu, A. Rossbach, M. Nomikos, V. Vassilakopoulou, E. Livaniou, B. Cumbes, F. Lai, C. George, K. Swann

Biochemical Journal. 2011, 438, 545-553

https://doi.org/10.1042/BJ20101581

Article | Google Scholar

9,
Human PLC  exhibits superior fertilization potency over mouse PLC  in triggering the Ca2+ oscillations required for mammalian oocyte activation

M. Nomikos, M. Theodoridou, K. Elgmati, D. Parthimos, B. Calver, L. Buntwal, G. Nounesis, K. Swann, F. Lai

Molecular Human Reproduction. 2014, 20, 489-498

https://doi.org/10.1093/molehr/gau011

Article | Google Scholar

10,
Recombinant Phospholipase Cζ Has High Ca2+ Sensitivity and Induces Ca2+ Oscillations in Mouse Eggs

Z. Kouchi, K. Fukami, T. Shikano, S. Oda, Y. Nakamura, T. Takenawa, S. Miyazaki

Journal of Biological Chemistry. 2004, 279, 10408-10412

https://doi.org/10.1074/jbc.M313801200

Article | Google Scholar

11
Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations

M. Nomikos, L. Blayney, M. Larman, K. Campbell, A. Rossbach, C. Saunders, K. Swann, F. Lai

Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 31011-31018

https://doi.org/10.1074/jbc.M500629200

Article | Google Scholar

]
) по разным источникам. Однако, как показано ниже, такое высокое значение коэффициента Хилла несовместимо с данными, представленными в этих статьях. Поэтому коэффициент Хилла рассчитывался двумя разными методами. Было показано, что его значение, по данным
[
10
Recombinant Phospholipase Cζ Has High Ca2+ Sensitivity and Induces Ca2+ Oscillations in Mouse Eggs

Z. Kouchi, K. Fukami, T. Shikano, S. Oda, Y. Nakamura, T. Takenawa, S. Miyazaki

Journal of Biological Chemistry. 2004, 279, 10408-10412

https://doi.org/10.1074/jbc.M313801200

Article | Google Scholar

]
, близко к 1.1.
Была создана простая математическая модель, которая могла предсказать зависимость активности PLCζ от кальция при его физиологически значимых концентрациях \( \left(10^{-8}-10^{-6} M\right) \)). Модель была основана на уравнении Клотца (1) и гипотезе о том, что каждый следующий ион кальция связывается с коэффициентом равновесия, равным предыдущему, умноженным на константу кооперативности a (2-5) \begin{equation} B=\frac{\left[P L C z_{-} C a\right]+2 *\left[P L C z_{-} 2 C a\right]+3 *\left[P L C z_{-} 3 C a\right]+4 *\left[P L C z_{-} 4 C a\right]}{P L Ctotal} = \\ = \frac{K e q *[C a]+2 * a * K e q^{2} *[C a]^{2}+3 * a^{3} * K e q^{3} *[C a]^{3}+4 * a^{6} * K e q^{4} *[C a]^{4}}{1+K e q *[C a]+a * K e q^{2} *[C a]^{2}+a^{3} * K e q^{3} *[C a]^{3}+a^{6} * K e q^{4} *[C a]^{4}}\tag{1}\end{equation}
 
\begin{equation} K 2=K 1 * a\tag{2}\end{equation} \begin{equation} K 3=K 1 * a^{2}\tag{3}\end{equation} \begin{equation} K 4=K 1 * a^{3}\tag{4}\end{equation} \begin{equation} K r=K 1 / K e q\tag{5}\end{equation}

здесь K1 - константа для связывания первого иона кальция, K2 - для связывания второго иона кальция, K3 - для третьего, K4 - для четвертого, Keq - константа равновесия для первой реакции связывания иона кальция, Kr - константа обратной реакции для каждого шага, a - константа кооперативности, \( \left[P L C z_{-} C a\right] \) - концентрация PLCζ, связанной с одним ионом Ca2+ в установившемся состоянии, \( \left[P L C z_{-} 2 C a\right] \) - концентрация PLCζ, связанной с двумя ионами Ca2+ в установившемся состоянии, \( \left[P L C z_{-} 3 C a\right] \) - с тремя, \( \left[P L C z_{-} 4 C a\right] \) - с четырьмя. \( \text { PLCtotal } \)— это суммарная концентрация всех форм PLCζ. B - параметр в уравнении Клотца, представляющий молярное соотношение общей PLCζ и связанного с ней кальция.
Используя уравнения 2-5, была разработана математическая модель, основанная на законе действующих масс. Концентрация кальция в этой модели была фиксированной, а переменные представляют динамику PLCζ, связанной с различным количеством ионов кальция: \begin{equation} \frac{d[P L C z]}{d t}=-K 1 *[\mathrm{Ca}] *[P L C z]+K r *\left[P L C z_{-} \mathrm{Ca}\right]\tag{6}\end{equation}  
 
\begin{equation} \frac{d\left[P L C z_{-} C a\right]}{d t}=K 1 *[C a] *[P L C z]-K r *\left[P L C z_{-} C a\right] - \\ - K 2 *[C a] *\left[P L C z_{-} C a\right] +K r *\left[P L C z_{-} 2 C a\right]\tag{7}\end{equation} 
 
\begin{equation} \frac{d[PLCz_{-} 2Ca]}{dt} = K2 * [Ca] * [PLCz_{-}Ca] - K r * [PLCz_{-}2Ca] - \\ - K3 * [Ca] * [PLCz_{-}2Ca] + K r * [PLCz_{-}3Ca]\tag{8}\end{equation} 
 
\begin{equation} \frac{d[PLCz_{-} 3Ca]}{dt} = K3 * [Ca] * [PLCz_{-}2Ca] - K r * [PLCz_{-}3Ca] - \\ - K4 * [Ca] * [PLCz_{-}3Ca] + K r * [PLCz_{-}4Ca]\tag{9}\end{equation} 
 
\begin{equation} \frac{d[PLCz_{-}4Ca]}{dt} = K4 * [Ca] * [PLCz_{-}3Ca] - K r * [PLCz_{-}4Ca]\tag{10}\end{equation}

здесь K1 - константа для связывания первого иона Ca2+, K2 - для второго, K3 - для третьего, K4 - для четвертого, Keq - константа равновесия для первой реакции связывания иона Ca2+, Kr - константа обратной реакции для каждого шага, a - константа кооперативности, \( [P L C z] \). Концентрация PLCζ, \( \left[P L C z_{-} C a\right] \) — это концентрация PLCζ, связанной с одним ионом Ca2+ в установившемся состоянии, \( \left[P L C z_{-} 2 C a\right] \) - концентрация PLCζ, связанной с двумя ионами Ca2+ в установившемся состоянии, \( \left[P L C z_{-} 3 C a\right] \) - с тремя, \( \left[P L C z_{-} 4 C a\right] \) - с четырьмя.
Исследование стационарного состояния модели приведено на рисунке S1.
% активной PLCζ рассчитывался как: \begin{equation} \frac{0.03 * [PLCz_{-}2Ca] + 0.22 * [PLCz_{-}3Ca] + [PLCz_{-}4Ca]}{PLCtotal} = \% \ of\ activity\tag{11}\end{equation} 
Этот параметр зависит от концентраций форм PLCζ, связанных с двумя, тремя или четырьмя ионами кальция. Коэффициенты для пересчета активности концентраций этих форм взяты из данных о максимальной активности PLCζ с удалением одной или двух EF-ручек
[
12
The Role of EF-hand Domains and C2 Domain in Regulation of Enzymatic Activity of Phospholipase Cζ

Z. Kouchi, T. Shikano, Y. Nakamura, H. Shirakawa, K. Fukami, S. Miyazaki

Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 21015-21021

https://doi.org/10.1074/jbc.M412123200

Article | Google Scholar

]
. Для PLCζ, связанного с тремя ионами кальция, использовали данные о PLCζ с одной делецией EF-hand (в данном случае активность составляла 22% от активности нативной формы фермента). Для PLCζ, связанной с двумя ионами кальция, использовали данные о PLCζ с двумя делециями EF-ручек (в данном случае активность составляла 0,03% от активности нативной формы фермента).
Подбор параметров модели проводился с использованием генетического алгоритма. Экспериментальная активность фермента по отношению к максимуму (% активности) была получена из литературных данных.
Модель предсказала константу равновесия Keq = 8,3 * 108 M-1 и константу кооперативности a = 0.33. Используя эти значения, была построена зависимость активности PLCζ от концентрации кальция (рис. 2А).

Аппроксимация активности PLCζ с помощью уравнения Хилла

В качестве альтернативного подхода к описанию активности PLCζ мы использовали уравнение Хилла. Уравнение Хилла для фермента имеет следующий вид: \begin{equation} \frac{E}{Emax} = \frac{[Ca]^n}{[EC50]^n + [Ca]^n}\tag{12}\end{equation}
E - активность PLCζ, \( \text { Emax } \) - максимальная активность PLCζ, EC50 - концентрация кальция, необходимая для 50% активности, [Ca] - концентрация кальция, n - коэффициент Хилла.
Если мы возьмем коэффициент Хилла из
[
11
Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations

M. Nomikos, L. Blayney, M. Larman, K. Campbell, A. Rossbach, C. Saunders, K. Swann, F. Lai

Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 31011-31018

https://doi.org/10.1074/jbc.M500629200

Article | Google Scholar

]
, (n = 4.3), будет получена кальциевая зависимость, которую можно наблюдать на рис. 2В. Данная зависимость аппроксимирует экспериментальные данные с гораздо большим стандартным отклонением, нежели наша модель, описанная в (6) - (10). То же верно и для коэффициента Хилла, полученного из
[
12
The Role of EF-hand Domains and C2 Domain in Regulation of Enzymatic Activity of Phospholipase Cζ

Z. Kouchi, T. Shikano, Y. Nakamura, H. Shirakawa, K. Fukami, S. Miyazaki

Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 21015-21021

https://doi.org/10.1074/jbc.M412123200

Article | Google Scholar

]
(n = 0.9).
Коэффициент Хилла можно оценить по данным о концентрации кальция при различных активностях (ЕС90 и ЕС10 - 90% и 10% от максимальной активности соответственно). \begin{equation} n=\frac{\log 10(81)}{\log 10(E C 90 / E C 10)}\tag{13}\end{equation}
Для активности PLCζ, предсказанной нашей моделью, EC90 составляет \( 2.7 * 10^{-7} M \), а EC10 \( 5.3 * 10^{-9} M \). Используя уравнение (13), мы можем найти, что коэффициент Хилла для PLCζ равен до 1.12.
Аналогично были исследованы данные из
[
11
Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations

M. Nomikos, L. Blayney, M. Larman, K. Campbell, A. Rossbach, C. Saunders, K. Swann, F. Lai

Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 31011-31018

https://doi.org/10.1074/jbc.M500629200

Article | Google Scholar

]
. Для PLCζ EC90 составляет \( 4.3 * 10^{-7} M \), а EC10 - \( 8 * 10^{-9} M \). Используя то же уравнение (13), мы можем найти, что фактический экспериментальный коэффициент Хилла для PLCζ приблизительно равен 1.1, что хорошо соответствует предсказаниям нашей модели.
Проверка моделей. (A) Подтверждение нашей модели связывания кальция с экспериментальными данными из [10]. (B) Сравнение уравнения Хилла для n = 4.3 с экспериментальными данными из [10]. (C) Сравнение уравнения Хилла для n = 0.9 с экспериментальными данными из [10]. (D) Сравнение уравнения Хилла для n = 1.1 с экспериментальными данными из [10].
Figure 2. Проверка моделей. (A) Подтверждение нашей модели связывания кальция с экспериментальными данными из [10]. (B) Сравнение уравнения Хилла для n = 4.3 с экспериментальными данными из [10]. (C) Сравнение уравнения Хилла для n = 0.9 с экспериментальными данными из [10]. (D) Сравнение уравнения Хилла для n = 1.1 с экспериментальными данными из [10].
 

Полная модель активности фосфолипазы С в сперматозоидах и яйцеклетках млекопитающих

Была разработана полная модель активности PLCζ в яйцеклетках (рис. 3A) и на мембранах сперматозоидов (рис. 3B). Для сперматозоидов и яйцеклеток использовались два похожих набора реакций. PLCζ могла независимо связывать кальций и доступные плазматические мембраны, но только форма, которая была связана как с мембраной, так и с четырьмя ионами кальция, могла производить IP3. IP3 удалялся из системы с постоянной скоростью. Различия между двумя моделями заключались в следующем: яйцеклетка содержит везикулы, богатые фосфоинозитидами, а сперматозоиды - нет. Все реакции, происходящие на мембране везикул, дублируют реакции, происходящие на плазмалемме. Константы реакции между схемами не различались, за исключением наличия отдельной константы для связывания PLC с везикулами в модели ооцита и константы скорости деградации инозитол-3-фосфата.
С использованием схем, описанных выше, были созданы две модели: модель активности PLCζ в ооците (рис. 3, А) и в сперматозоидах (рис. 3, В). Уравнения моделей описаны в S2. Подробная информация о параметрах моделей представлена в Таблице S1.
Схема полной модели. (A) Реакции в ооците. PLCζ - бескальциевый PLCζ, PLCζ_Ca - PLCζ, связанная с одним ионом кальция, PLCζ_2Ca - PLCζ, связанная с двумя ионами кальция, PLCζ_3Ca - с тремя, PLCζ_4Ca - с четырьмя. PLCζ_m - PLCζ, связанная с клеточной мембраной, PLCζ_ (Ca m) - PLCζ, связанная с клеточной мембраной и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca m) - PLCζ, связанная с клеточной мембраной и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca m) - с клеточной мембраной и тремя ионами кальция, PLCζ_ (4Ca m) - с клеточной мембраной и четырьмя ионами кальция. PIP2 и PIP2_v - фосфатидилинозитол-4,5 - бис-фосфат на мембране клеток и везикул соответственно. DAG и DAG_v - диацилглицерол на клеточной мембране и везикулах соответственно. IP3 - инозитол-3-фосфат. PLCζ_v - PLCζ, связанная с везикулами, PLCζ_ (Ca v) - PLCζ, связанная с везикулами и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca v) - PLCζ, связанная с везикулами и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca v) - с везикулами и тремя ионы кальция, PLCζ_ (4Ca v) - с везикулами и четырьмя ионами кальция. (B) Модель сперматозоидов идентична модели ооцита, за исключением отсутствия везикул.
Figure 3. Схема полной модели. (A) Реакции в ооците. PLCζ - бескальциевый PLCζ, PLCζ_Ca - PLCζ, связанная с одним ионом кальция, PLCζ_2Ca - PLCζ, связанная с двумя ионами кальция, PLCζ_3Ca - с тремя, PLCζ_4Ca - с четырьмя. PLCζ_m - PLCζ, связанная с клеточной мембраной, PLCζ_ (Ca m) - PLCζ, связанная с клеточной мембраной и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca m) - PLCζ, связанная с клеточной мембраной и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca m) - с клеточной мембраной и тремя ионами кальция, PLCζ_ (4Ca m) - с клеточной мембраной и четырьмя ионами кальция. PIP2 и PIP2_v - фосфатидилинозитол-4,5 - бис-фосфат на мембране клеток и везикул соответственно. DAG и DAG_v - диацилглицерол на клеточной мембране и везикулах соответственно. IP3 - инозитол-3-фосфат. PLCζ_v - PLCζ, связанная с везикулами, PLCζ_ (Ca v) - PLCζ, связанная с везикулами и одним ионом кальция, PLCζ_ (2Ca v) - PLCζ, связанная с везикулами и двумя ионами кальция, PLCζ_ (3Ca v) - с везикулами и тремя ионы кальция, PLCζ_ (4Ca v) - с везикулами и четырьмя ионами кальция. (B) Модель сперматозоидов идентична модели ооцита, за исключением отсутствия везикул.
 
Зависимость концентрации IP3 от концентрации PIP2 на различных мембранах показана на рис. 4. В обеих моделях существовало только одно стационарное состояние. Стационарная концентрация IP3 в сперматозоиде составляла приблизительно 50-60 нМ, а в ооците концентрация IP3 составляла около 200 нМ (что выше порога ответа 130 нМ
[
13
A single-pool inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-based model for agonist-stimulated oscillations in Ca2+ concentration.

G. De Young, J. Keizer

Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992, 89, 9895-9899

https://doi.org/10.1073/pnas.89.20.9895

Article | Google Scholar

]
для рецепторов IP3, присутствующих как в сперматозоидах, так и в ооцитах
[
13
A single-pool inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-based model for agonist-stimulated oscillations in Ca2+ concentration.

G. De Young, J. Keizer

Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992, 89, 9895-9899

https://doi.org/10.1073/pnas.89.20.9895

Article | Google Scholar

]
). Таким образом, согласно точечной модели, активности одной только PLCζ должно быть достаточно, чтобы инициировать колебания кальция в ооците.
В сперматозоиде конечная концентрация инозитол-3-фосфата в зависимости от концентрации PIP2 достигает плато задолго до достижения даже половины пороговой концентрации (130 нМ).
Снижение концентрации фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата на поверхности везикул в 10 раз снизит конечную концентрацию инозитол-3-фосфата примерно до 20-30 нМ и исключит возможность кальциевых колебаний в ооците, вызванных исключительно PLCζ (рис. 4B). Это объясняет как отсутствие колебаний при инициации экспрессии PLCζ в соматических клетках
[
2
Broad, ectopic expression of the sperm protein PLCZ1 induces parthenogenesis and ovarian tumours in mice

N. Yoshida, M. Amanai, T. Fukui, E. Kajikawa, M. Brahmajosyula, A. Iwahori, Y. Nakano, S. Shoji, J. Diebold, H. Hessel, R. Huss, A. Perry

Development. 2007, 134, 3941-3952

https://doi.org/10.1242/dev.007930

Article | Google Scholar

]
, так и отсутствие колебаний в аналогичных условиях на ранних стадиях созревания ооцитов до образования везикул, богатых фосфатидилинозитол-4,5-бис-фосфатом
[
16
Calcium oscillations in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein

J. Parrington, K. Swann, V. Shevchenko, A. Sesay, F. Lai

Nature. 1996, 379, 364-368

https://doi.org/10.1038/379364a0

Article | Google Scholar

]
.
Результаты полной модели. (A) Зависимость концентрации IP3 от содержания PIP2 в мембране сперматозоидов. (B) Зависимость концентрации IP3 от содержания PIP2 в везикулах ооцитов.
Figure 4. Результаты полной модели. (A) Зависимость концентрации IP3 от содержания PIP2 в мембране сперматозоидов. (B) Зависимость концентрации IP3 от содержания PIP2 в везикулах ооцитов.

Заключение

Здесь мы построили математическую модель активности PLC ζ в яйцеклетках и сперматозоидах млекопитающих и проверили ее на существующих экспериментальных данных. Теоретически было показано, что активность PLCζ в сперматозоидах недостаточна для синтеза IP3 в количествах, достаточных для инициации кальциевых колебаний. Благодаря везикулам в яйцеклетках PLCζ может наработать общую концентрацию IP3, близкую к 200 нМ, что выше граничного значения для инициирования колебаний Са.
Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что фосфоинозитидный состав везикул яйцеклеток является основным фактором эффективности PLC ζ как инициатора кальциевых колебаний. Они исключают возможность кальциевых колебаний в сперматозоиде, что согласуется со всеми имеющимися в настоящее время экспериментальными данными.

Библиографические ссылки статьи:

  1. Essential Role of Sperm-Specific PLC-Zeta in Egg Activation and Male Factor Infertility: An Update

    A. Saleh, J. Kashir, A. Thanassoulas, B. Safieh-Garabedian, F. Lai, M. Nomikos

    Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2020, 8,

    https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00028

    Article|Google Scholar

  2. Broad, ectopic expression of the sperm protein PLCZ1 induces parthenogenesis and ovarian tumours in mice

    N. Yoshida, M. Amanai, T. Fukui, E. Kajikawa, M. Brahmajosyula, A. Iwahori, Y. Nakano, S. Shoji, J. Diebold, H. Hessel, R. Huss, A. Perry

    Development. 2007, 134, 3941-3952

    https://doi.org/10.1242/dev.007930

    Article|Google Scholar

  3. Phospholipase C zeta and calcium oscillations at fertilisation: The evidence, applications, and further questions

    J. Kashir, M. Nomikos, F. Lai

    Advances in Biological Regulation. 2018, 67, 148-162

    https://doi.org/10.1016/j.jbior.2017.10.012

    Article|Google Scholar

  4. PLCζ is the physiological trigger of the Ca2+ oscillations that induce embryogenesis in mammals but offspring can be conceived in its absence.

    Hachem A, Godwin J, Ruas M, Lee HC, Buitrago MF, Ardestani G, et al.

    Development. 2017, ,

    https://doi.org/10.1242/dev.150227

    Article|Google Scholar

  5. Divergent effect of mammalian PLCζ in generating Ca2+ oscillations in somatic cells compared with eggs

    S. Phillips, Y. Yu, A. Rossbach, M. Nomikos, V. Vassilakopoulou, E. Livaniou, B. Cumbes, F. Lai, C. George, K. Swann

    Biochemical Journal. 2011, 438, 545-553

    https://doi.org/10.1042/BJ20101581

    Article|Google Scholar

  6. Starting a new life: Sperm PLC-zeta mobilizes the Ca2+ signal that induces egg activation and embryo development

    M. Nomikos, K. Swann, F. Lai

    BioEssays. 2012, 34, 126-134

    https://doi.org/10.1002/bies.201100127

    Article|Google Scholar

  7. A single-pool model for intracellular calcium oscillations and waves in the Xenopus laevis oocyte

    A. Atri, J. Amundson, D. Clapham, J. Sneyd

    Biophysical Journal. 1993, 65, 1727-1739

    https://doi.org/10.1016/S0006-3495(93)81191-3

    Article|Google Scholar

  8. A Model for the Acrosome Reaction in Mammalian Sperm

    J. Simons, L. Fauci

    Bulletin of Mathematical Biology. 2018, 80, 2481-2501

    https://doi.org/10.1007/s11538-018-0478-3

    Article|Google Scholar

  9. Human PLC  exhibits superior fertilization potency over mouse PLC  in triggering the Ca2+ oscillations required for mammalian oocyte activation

    M. Nomikos, M. Theodoridou, K. Elgmati, D. Parthimos, B. Calver, L. Buntwal, G. Nounesis, K. Swann, F. Lai

    Molecular Human Reproduction. 2014, 20, 489-498

    https://doi.org/10.1093/molehr/gau011

    Article|Google Scholar

  10. Recombinant Phospholipase Cζ Has High Ca2+ Sensitivity and Induces Ca2+ Oscillations in Mouse Eggs

    Z. Kouchi, K. Fukami, T. Shikano, S. Oda, Y. Nakamura, T. Takenawa, S. Miyazaki

    Journal of Biological Chemistry. 2004, 279, 10408-10412

    https://doi.org/10.1074/jbc.M313801200

    Article|Google Scholar

  11. Role of Phospholipase C-ζ Domains in Ca2+-dependent Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis and Cytoplasmic Ca2+ Oscillations

    M. Nomikos, L. Blayney, M. Larman, K. Campbell, A. Rossbach, C. Saunders, K. Swann, F. Lai

    Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 31011-31018

    https://doi.org/10.1074/jbc.M500629200

    Article|Google Scholar

  12. The Role of EF-hand Domains and C2 Domain in Regulation of Enzymatic Activity of Phospholipase Cζ

    Z. Kouchi, T. Shikano, Y. Nakamura, H. Shirakawa, K. Fukami, S. Miyazaki

    Journal of Biological Chemistry. 2005, 280, 21015-21021

    https://doi.org/10.1074/jbc.M412123200

    Article|Google Scholar

  13. A single-pool inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-based model for agonist-stimulated oscillations in Ca2+ concentration.

    G. De Young, J. Keizer

    Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992, 89, 9895-9899

    https://doi.org/10.1073/pnas.89.20.9895

    Article|Google Scholar

  14. Are there inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) receptors in human sperm?

    Y. Kuroda, S. Kaneko, Y. Yoshimura, S. Nozawa, K. Mikoshiba

    Life Sciences. 1999, 65, 135-143

    https://doi.org/10.1016/S0024-3205(99)00230-1

    Article|Google Scholar

  15. Comparison of gating dynamics of different IP3R channels with immune algorithm searching for channel parameter distributions

    X. Cai, X. Li, H. Qi, F. Wei, J. Chen, J. Shuai

    Physical Biology. 2016, 13, 056005

    https://doi.org/10.1088/1478-3975/13/5/056005

    Article|Google Scholar

  16. Calcium oscillations in mammalian eggs triggered by a soluble sperm protein

    J. Parrington, K. Swann, V. Shevchenko, A. Sesay, F. Lai

    Nature. 1996, 379, 364-368

    https://doi.org/10.1038/379364a0

    Article|Google Scholar