Оценка функциональной активности нейтрофилов с применением красителей феноксазинового ряда

Нейтрофилы используют широкий спектр возможностей для элиминации патогенов: фагоцитоз, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек, дегрануляцию, а также генерацию активных форм кислорода (АФК), азота (АФА) и галогенов (АФГ) [1]. Образование этих высокореакционных соединений начинается со сборки НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической или фагосомальной мембране нейтрофилов, что ведет к продукции супероксидного анион-радикала (O₂^•‾) [2]. O₂^•‾ − короткоживущий радикал, который самопроизвольно и/или при участии супероксиддисмутазы (СОД) дисмутирует до пероксида водорода (H₂O₂) [3]. H₂O₂ затем используется ферментом азурофильных гранул нейтрофилов – миелопероксидазой (МПО) для образования хлорноватистой (HOCl), бромноватистой (HOBr) и других высокореакционных гипогалоидных кислот [4]. Причем при физиологических концентрациях хлорид-аниона, HOCl является основным продуктом цикла галогенирования МПО [5].

HOCl реагирует с широким спектром биологических мишеней, включая белки, липиды, ДНК/РНК, углеводы, приводя к их деструкции или модификации [6]. При этом повышение концентрации/активности МПО, а также маркеров хлорирования (3-хлортирозин, 5-хлорурацил, α-хлоральдегиды, хлорированные белки и др.) отмечено при развитии окислительного/галогенирующего стресса. Такое состояние сопутствует воспалительному процессу при инфаркте миокарда, атеросклерозе, ревматоидном артрите, почечной недостаточности, муковисцидозе, сепсисе, раке, астме, болезнях Альцгеймера и др. [7–9].

Ввиду исключительной роли HOCl как в защите организма от патогенов, так и в развитии заболеваний, исследование пространственной локализации HOCl и галогенированных продуктов, определение ее концентрации в местах воспаления, а также регуляция каталитической активности МПО являются как фундаментальными, так и прикладными задачами, решение которых направлено на контроль за течением заболеваний, ассоциированных с воспалением, а также скрининг возможных лекарственных препаратов для лечения пациентов с вышеупомянутыми патологиями.

HOCl является высокореакционным соединением и быстро взаимодействует с различными биологическими мишенями (константы скоростей реакций HOCl с некоторыми низкомолекулярными соединениями и функциональными группами биополимеров превышает 10⁷ М^–1с^–1) [10,11]. При активации нейтрофилов следует учитывать и образование многочисленных других АФК, АФГ и АФА, что в совокупности затрудняет детектирование HOCl. На преодоление этих трудностей нацелено множество исследований, в которых для регистрации HOCl используются преимущественно флуоресцентные зонды [12–14]. Несмотря на то, что в последние годы синтезирован ряд зондов для регистрации HOCl и других АФК, АФА и АФГ, многие из них не лишены недостатков: обладают низкой стабильностью, подвержены фотообесцвечиванию, неэффективны вблизи физиологических значений pH [15].

В виду своих уникальных физико-химических свойств феноксазины нашли применение во многих сферах: в материаловедении, органических светодиодах, фотоокислительно-восстановительных катализаторах, солнечных элементах, сенсибилизированных красителях и др. Помимо этого, данный класс соединений обладает хорошей биосовместимостью [16–19]. Ранее нами было показано, что галлоцианин (GC) может использоваться в качестве флуоресцентного зонда для регистрации образования O₂^•‾ [20], а целестиновый синий B (CB) – для регистрации образования АФГ [21]. В данной работе была исследована возможность использования обоих красителей качестве альтернативы менее избирательным флуоресцентным зондам – скополетину (SP) и аминофенил флуоресцеину (APF) для регистрации АФК и АФГ нейтрофилами.

В работе использовали следующие реактивы: цитрат натрия, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), цитохалазин B (cyth B), гипохлорит натрия (NaOCl), таурин (Tau), форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), SP, GC, CB, APF и гистопак (1,077 г/мл) – фирмы «Sigma-Aldrich» (США); декстран Т70 – фирмы «Roth» (Германия); пероксидаза хрена и азид натрия – фирмы «Nycomed» (Норвегия); лектины растений – фирмы «Лектинотест» (Львов, Украина). Остальные реактивы от заводов «Реахим» (Россия) и «Белмедпрепараты» (Беларусь).

Нейтрофилы выделяли из донорской крови, стабилизированной цитратом натрия, путем центрифугирования с использованием декстрана T70 и гистопака с плотностью 1,077 г/мл. Исследования проводились в соответствие с Хельсинской Декларацией и одобрены этическим комитетом РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий (решение №1 от 10.04.2022 г., г. Минск, Беларусь).

Продукцию АФК и АФГ в клеточной суспензии оценивали флуоресцентным методом с использованием соответствующих зондов. Продукцию Н₂О₂ оценивали флуоресцентным методом с использованием SP в качестве субстрата пероксидазной реакции (λ_ex=350 нм, λ_em=460 нм). Образование HOCl и ее производных регистрировали флуоресцентным методом с применением СВ (λ_ex=460 нм, λ_em=590 нм) или APF (λ_ex=490 нм, λ_em=520 нм). Продукцию O₂^•‾ оценивали флуоресцентным методом с использованием GC (λ_ex=360 нм, λ_em=480 нм). Измерения проводили на спектрофлуориметре Solar CM 2203 (Минск, Беларусь).

Внутриклеточную продукцию АФГ нейтрофилами исследовали методом проточной цитометрии с использованием СВ или APF по увеличению интенсивности флуоресценции в FITC канале (λ_ex=488 нм, λ_em=525±40 нм) при помощи проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США).

В качестве агонистов нейтрофилов использовали различные стимуляторы: хемотаксический пептид fMLP (100 нМ), форболовый эфир PMA (100 нМ), а также растительные лектины с различной углеводной специфичностью: WGA (Triticum vulgaris агглютинин), специфичный к остаткам GlcNAc и NeuNAc, и маннозо-специфичный Con A (Canavalia ensiformis агглютинин) (по 50 мкг/мл).

На рисунке 1 приведены данные о влиянии агонистов различной природы (fMLP, PMA, Con A и WGA) на скорость продукции Н₂О₂ (тест со SP), O₂^• ‾ (тест с GC), HOCl и ее производных (APF и CB) нейтрофилами. Из рисунка 1б,г видно, что все используемые стимулы вызывали увеличение продукции АФК по сравнению с контролем (тест с GC и SP). Интересно отметить, что скорость изменения интенсивности флуоресценции при регистрации АФК (при использовании GC и SP) различна у разных активаторов. Используемые стимулы по выраженности флуоресцентного ответа можно расположить в последовательности: PMA>fMLP>WGA≈Con A. Данный факт является дополнительным косвенным подтверждением того, что GC в клеточной суспензии является зондом, взаимодействующим в первую очередь с O₂^•‾, который затем, дисмутируя, превращается в Н₂О₂, используемый пероксидазой хрена в SP-тесте.

Лектины растений не вызывали увеличение продукции АФГ нейтрофилами, регистрируемой при помощи CB и APF (рисунок 1а,в). Известно, что для экзоцитоза содержимого азурофильных гранул и, следовательно, продукции АФГ нейтрофилами, при активации этих клеток по рецептор-зависимому механизму (лектинами растений, fMLP), необходима предварительная инкубация клеток с cyth В, который препятствует полимеризации фибриллярного актина цитоскелета [22]. PMA, являясь липофильным соединением, легко проникает в клетки и инициирует респираторный взрыв и дегрануляцию нейтрофилов [23] и без помощи cyth B. Из рисунка 1 а видно, что в присутствии cyth B наблюдалась продукция АФГ нейтрофилами, активированными fMLP, WGA и Con A (тест с CB). Интересно отметить, что отличительной особенностью APF является наличие флуоресцентного сигнала при активации нейтрофилов fMLP в отсутствие cyth B (рисунок 1в). Данный эффект может быть связан с внутриклеточной продукцией HOCl или вкладом гидроксильного радикала, который также может влиять на изменение интенсивности флуоресценции APF [24].

Figure 1. Скорость изменения интенсивности флуоресценции зондов в суспензии активированных нейтрофилов. *p<0,05 относительно контроля

Метод проточной цитометрии — современный, удобный и информативный метод идентификации и количественного определения как экспрессии поверхностных маркеров клеток, так и оценки их функциональной активности [25]. Исследование внутриклеточной продукции АФГ нейтрофилами является важным критерием оценки их функционального состояния, поэтому нами была исследована возможность регистрации внутриклеточной продукции АФГ методом проточной цитометрии с использованием CB, а также сравнение возможности использования для этих целей широко применяемого APF и СВ.

В качестве агонистов, стимулирующих продукцию АФГ нейтрофилами, использовали PMA, fMLP и WGA. Типичные гистограммы распределения нейтрофилов по интенсивности флуоресценции в случае загрузки клеток CB и APF представлены на рисунке 2. Как видно из рисунка, все исследуемые агонисты вызывали увеличение числа CB- и APF-положительных событий, а также медианы распределения числа клеток по интенсивности флуоресценции как для CB, так и для APF (данные не представлены). Таким образом, показано, что CB может быть использован в качестве альтернативы APF для исследования внутриклеточной продукции АФГ.

Figure 2. Типичные гистограммы распределения интенсивности флуоресценции нейтрофилов при загрузке клеток CB и APF и активации различными агонистами

Заключение:

Продукция АФК и АФГ нейтрофилами является важным критерием оценки функционального состояния этих клеток, однако поиск коммерчески доступных, чувствительных и избирательных флуоресцентных зондов для решения этой задачи остается по-прежнему актуальным. Данной проблематике в последние годы посвящено множество работ, в том числе по разработке флуоресцентных зондов на основе феноксазинового каркаса [16–18].

В данной работе был предложен комплексный подход с применением флуоресцентных зондов феноксазинового ряда для регистрации образования АФК и АФГ нейтрофилами, активированными агонистами различной природы. Установлено, что GC и CB могут быть успешно применены для регистрации образования соответственно АФК и АФГ в суспензиях активированных нейтрофилов. Показано, что CB может быть использован в качестве коммерческого флуоресцентного зонда для регистрации внутриклеточной продукции АФГ нейтрофилами методом проточной цитометрии.

Вклад авторов