Оценка функциональной активности нейтрофилов с применением красителей феноксазинового ряда
Нейтрофилы используют широкий спектр возможностей для элиминации патогенов: фагоцитоз, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек, дегрануляцию, а также генерацию активных форм кислорода (АФК), азота (АФА) и галогенов (АФГ) [1]. Образование этих высокореакционных соединений начинается со сборки НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической или фагосомальной мембране нейтрофилов, что ведет к продукции супероксидного анион-радикала (O2•‾) [2]. O2•‾ − короткоживущий радикал, который самопроизвольно и/или при участии супероксиддисмутазы (СОД) дисмутирует до пероксида водорода (H2O2) [3]. H2O2 затем используется ферментом азурофильных гранул нейтрофилов – миелопероксидазой (МПО) для образования хлорноватистой (HOCl), бромноватистой (HOBr) и других высокореакционных гипогалоидных кислот [4]. Причем при физиологических концентрациях хлорид-аниона, HOCl является основным продуктом цикла галогенирования МПО [5].
HOCl реагирует с широким спектром биологических мишеней, включая белки, липиды, ДНК/РНК, углеводы, приводя к их деструкции или модификации [6]. При этом повышение концентрации/активности МПО, а также маркеров хлорирования (3-хлортирозин, 5-хлорурацил, α-хлоральдегиды, хлорированные белки и др.) отмечено при развитии окислительного/галогенирующего стресса. Такое состояние сопутствует воспалительному процессу при инфаркте миокарда, атеросклерозе, ревматоидном артрите, почечной недостаточности, муковисцидозе, сепсисе, раке, астме, болезнях Альцгеймера и др. [7–9].
Ввиду исключительной роли HOCl как в защите организма от патогенов, так и в развитии заболеваний, исследование пространственной локализации HOCl и галогенированных продуктов, определение ее концентрации в местах воспаления, а также регуляция каталитической активности МПО являются как фундаментальными, так и прикладными задачами, решение которых направлено на контроль за течением заболеваний, ассоциированных с воспалением, а также скрининг возможных лекарственных препаратов для лечения пациентов с вышеупомянутыми патологиями.
HOCl является высокореакционным соединением и быстро взаимодействует с различными биологическими мишенями (константы скоростей реакций HOCl с некоторыми низкомолекулярными соединениями и функциональными группами биополимеров превышает 107 М–1с–1) [10,11]. При активации нейтрофилов следует учитывать и образование многочисленных других АФК, АФГ и АФА, что в совокупности затрудняет детектирование HOCl. На преодоление этих трудностей нацелено множество исследований, в которых для регистрации HOCl используются преимущественно флуоресцентные зонды [12–14]. Несмотря на то, что в последние годы синтезирован ряд зондов для регистрации HOCl и других АФК, АФА и АФГ, многие из них не лишены недостатков: обладают низкой стабильностью, подвержены фотообесцвечиванию, неэффективны вблизи физиологических значений pH [15].
В виду своих уникальных физико-химических свойств феноксазины нашли применение во многих сферах: в материаловедении, органических светодиодах, фотоокислительно-восстановительных катализаторах, солнечных элементах, сенсибилизированных красителях и др. Помимо этого, данный класс соединений обладает хорошей биосовместимостью [16–19]. Ранее нами было показано, что галлоцианин (GC) может использоваться в качестве флуоресцентного зонда для регистрации образования O2•‾ [20], а целестиновый синий B (CB) – для регистрации образования АФГ [21]. В данной работе была исследована возможность использования обоих красителей качестве альтернативы менее избирательным флуоресцентным зондам – скополетину (SP) и аминофенил флуоресцеину (APF) для регистрации АФК и АФГ нейтрофилами.
В работе использовали следующие реактивы: цитрат натрия, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), цитохалазин B (cyth B), гипохлорит натрия (NaOCl), таурин (Tau), форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA), SP, GC, CB, APF и гистопак (1,077 г/мл) – фирмы «Sigma-Aldrich» (США); декстран Т70 – фирмы «Roth» (Германия); пероксидаза хрена и азид натрия – фирмы «Nycomed» (Норвегия); лектины растений – фирмы «Лектинотест» (Львов, Украина). Остальные реактивы от заводов «Реахим» (Россия) и «Белмедпрепараты» (Беларусь).
Нейтрофилы выделяли из донорской крови, стабилизированной цитратом натрия, путем центрифугирования с использованием декстрана T70 и гистопака с плотностью 1,077 г/мл. Исследования проводились в соответствие с Хельсинской Декларацией и одобрены этическим комитетом РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий (решение №1 от 10.04.2022 г., г. Минск, Беларусь).
Продукцию АФК и АФГ в клеточной суспензии оценивали флуоресцентным методом с использованием соответствующих зондов. Продукцию Н2О2 оценивали флуоресцентным методом с использованием SP в качестве субстрата пероксидазной реакции (λex=350 нм, λem=460 нм). Образование HOCl и ее производных регистрировали флуоресцентным методом с применением СВ (λex=460 нм, λem=590 нм) или APF (λex=490 нм, λem=520 нм). Продукцию O2•‾ оценивали флуоресцентным методом с использованием GC (λex=360 нм, λem=480 нм). Измерения проводили на спектрофлуориметре Solar CM 2203 (Минск, Беларусь).
Внутриклеточную продукцию АФГ нейтрофилами исследовали методом проточной цитометрии с использованием СВ или APF по увеличению интенсивности флуоресценции в FITC канале (λex=488 нм, λem=525±40 нм) при помощи проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter, США).
В качестве агонистов нейтрофилов использовали различные стимуляторы: хемотаксический пептид fMLP (100 нМ), форболовый эфир PMA (100 нМ), а также растительные лектины с различной углеводной специфичностью: WGA (Triticum vulgaris агглютинин), специфичный к остаткам GlcNAc и NeuNAc, и маннозо-специфичный Con A (Canavalia ensiformis агглютинин) (по 50 мкг/мл).
На рисунке 1 приведены данные о влиянии агонистов различной природы (fMLP, PMA, Con A и WGA) на скорость продукции Н2О2 (тест со SP), O2• ‾ (тест с GC), HOCl и ее производных (APF и CB) нейтрофилами. Из рисунка 1б,г видно, что все используемые стимулы вызывали увеличение продукции АФК по сравнению с контролем (тест с GC и SP). Интересно отметить, что скорость изменения интенсивности флуоресценции при регистрации АФК (при использовании GC и SP) различна у разных активаторов. Используемые стимулы по выраженности флуоресцентного ответа можно расположить в последовательности: PMA>fMLP>WGA≈Con A. Данный факт является дополнительным косвенным подтверждением того, что GC в клеточной суспензии является зондом, взаимодействующим в первую очередь с O2•‾, который затем, дисмутируя, превращается в Н2О2, используемый пероксидазой хрена в SP-тесте.
Лектины растений не вызывали увеличение продукции АФГ нейтрофилами, регистрируемой при помощи CB и APF (рисунок 1а,в). Известно, что для экзоцитоза содержимого азурофильных гранул и, следовательно, продукции АФГ нейтрофилами, при активации этих клеток по рецептор-зависимому механизму (лектинами растений, fMLP), необходима предварительная инкубация клеток с cyth В, который препятствует полимеризации фибриллярного актина цитоскелета [22]. PMA, являясь липофильным соединением, легко проникает в клетки и инициирует респираторный взрыв и дегрануляцию нейтрофилов [23] и без помощи cyth B. Из рисунка 1 а видно, что в присутствии cyth B наблюдалась продукция АФГ нейтрофилами, активированными fMLP, WGA и Con A (тест с CB). Интересно отметить, что отличительной особенностью APF является наличие флуоресцентного сигнала при активации нейтрофилов fMLP в отсутствие cyth B (рисунок 1в). Данный эффект может быть связан с внутриклеточной продукцией HOCl или вкладом гидроксильного радикала, который также может влиять на изменение интенсивности флуоресценции APF [24].
![Скорость изменения интенсивности флуоресценции зондов в суспензии активированных нейтрофилов. *p<0,05 относительно контроля](https://astore.sbpreports.com/issues/articles/57/figures/Fig1.png?v=plcyo)
Метод проточной цитометрии — современный, удобный и информативный метод идентификации и количественного определения как экспрессии поверхностных маркеров клеток, так и оценки их функциональной активности [25]. Исследование внутриклеточной продукции АФГ нейтрофилами является важным критерием оценки их функционального состояния, поэтому нами была исследована возможность регистрации внутриклеточной продукции АФГ методом проточной цитометрии с использованием CB, а также сравнение возможности использования для этих целей широко применяемого APF и СВ.
В качестве агонистов, стимулирующих продукцию АФГ нейтрофилами, использовали PMA, fMLP и WGA. Типичные гистограммы распределения нейтрофилов по интенсивности флуоресценции в случае загрузки клеток CB и APF представлены на рисунке 2. Как видно из рисунка, все исследуемые агонисты вызывали увеличение числа CB- и APF-положительных событий, а также медианы распределения числа клеток по интенсивности флуоресценции как для CB, так и для APF (данные не представлены). Таким образом, показано, что CB может быть использован в качестве альтернативы APF для исследования внутриклеточной продукции АФГ.
![Типичные гистограммы распределения интенсивности флуоресценции нейтрофилов при загрузке клеток CB и APF и активации различными агонистами](https://astore.sbpreports.com/issues/articles/57/figures/Fig2.png?v=vdxwe)
Заключение:
Продукция АФК и АФГ нейтрофилами является важным критерием оценки функционального состояния этих клеток, однако поиск коммерчески доступных, чувствительных и избирательных флуоресцентных зондов для решения этой задачи остается по-прежнему актуальным. Данной проблематике в последние годы посвящено множество работ, в том числе по разработке флуоресцентных зондов на основе феноксазинового каркаса [16–18].
В данной работе был предложен комплексный подход с применением флуоресцентных зондов феноксазинового ряда для регистрации образования АФК и АФГ нейтрофилами, активированными агонистами различной природы. Установлено, что GC и CB могут быть успешно применены для регистрации образования соответственно АФК и АФГ в суспензиях активированных нейтрофилов. Показано, что CB может быть использован в качестве коммерческого флуоресцентного зонда для регистрации внутриклеточной продукции АФГ нейтрофилами методом проточной цитометрии.
Вклад авторов
Библиографические ссылки статьи:
The effects of neutrophil-generated hypochlorous acid and other hypohalous acids on host and pathogens
A. Ulfig, L. Leichert
Cellular and Molecular Life Sciences. 2021, 78, 385-414
Beyond oxidative stress: an immunologist's guide to reactive oxygen species
C. Nathan, A. Cunningham-Bussel
Nature Reviews Immunology. 2013, 13, 349-361
Bactericidal activity of a superoxide anion-generating system. A model for the polymorphonuclear leukocyte.
H. Rosen, S. Klebanoff
Journal of Experimental Medicine. 1979, 149, 27-39
The Role of Thiocyanate in Modulating Myeloperoxidase Activity during Disease
P. San Gabriel, Y. Liu, A. Schroder, H. Zoellner, B. Chami
International Journal of Molecular Sciences. , 21, 6450
Halogenation Activity of Mammalian Heme Peroxidases
J. Arnhold, E. Malle
Antioxidants. , 11, 890
Role of myeloperoxidase and oxidant formation in the extracellular environment in inflammation-induced tissue damage
C. Hawkins, M. Davies
Free Radical Biology and Medicine. 2021, 172, 633-651
Increased myeloperoxidase activity as an indicator of neutrophil-induced inflammation and sepsis in neonates
Gammasy TMA, Abushady NM, Hamza MT, Shaker R
Egyptian Journal of Pediatric Allergy and Immunology (The). 2015, 13, 15-20
Myeloperoxidase as an Active Disease Biomarker: Recent Biochemical and Pathological Perspectives
A. Khan, M. Alsahli, A. Rahmani
Medical Sciences. , 6, 33
Хлорноватистая кислота как предшественник свободных радикалов в живых системах
Панасенко ОМ, Горудко ИВ, Соколов АВ.
Успехи Биологической Химии. 2013, 53, 195-244
Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation
L. Zhang, X. Wang, R. Cueto, C. Effi, Y. Zhang, H. Tan, X. Qin, Y. Ji, X. Yang, H. Wang
Redox Biology. 2019, 26, 101284
Absolute Rate Constants for the Reaction of Hypochlorous Acid with Protein Side Chains and Peptide Bonds
D. Pattison, M. Davies
Chemical Research in Toxicology. 2001, 14, 1453-1464
Optical probes for detection and quantification of neutrophils’ oxidative burst. A review
M. Freitas, J. Lima, E. Fernandes
Analytica Chimica Acta. 2009, 649, 8-23
Optical imaging probes for biomolecules: an introductory perspective
J. Thomas
Chemical Society Reviews. , 44, 4494-4500
Methods for measuring myeloperoxidase activity toward assessing inhibitor efficacy in living systems
J. Huang, A. Milton, R. Arnold, H. Huang, F. Smith, J. Panizzi, P. Panizzi
Journal of Leukocyte Biology. 2016, 99, 541-548
Флуоресцентные зонды для обнаружения хлорноватистой кислоты в живых клетках.
Реут ВЕ, Горудко ИВ, Григорьева ДВ, Соколов АВ, Панасенко ОМ.
Биоорганическая Химия. 2022, 48, 415-41
A Novel Phenoxazine-based Fluorescent Probe for the Detection of HOCl in Living Cells
J. Yang, Y. Yao, Y. Shen, Y. Xu, G. Lv, C. Li
Zeitschrift für anorganische und allgemeine Chemie. 2020, 646, 431-436
A novel near-infrared fluorescent probe based on phenoxazine for the specific detection of HOCl
J. Yang, W. Zheng, Y. Shen, Y. Xu, G. Lv, C. Li
Journal of Luminescence. 2020, 226, 117460
The near-infrared fluorescent probes based on phenoxazine for the rapid detection of hypochlorous acid
W. Zheng, J. Yang, Y. Shen, Y. Yao, G. Lv, S. Hao, C. Li
Dyes and Pigments. 2020, 179, 108404
Synthetic, biological and optoelectronic properties of phenoxazine and its derivatives: a state of the art review
Sadhu C, Mitra AK.
Mol Divers. 2023, ,
Галлоцианин как флуороген для выявления NADPH-зависимой продукции супероксидного анион-радикала клетками крови
О. Панасенко, В. Реут, И. Бородина, Д. Матюшкина, В. Иванов, Д. Григорьева, И. Горудко, А. Соколов, С. Черенкевич
Биоорганическая химия. 2021, 47, 153-161
New Application of the Commercially Available Dye Celestine Blue B as a Sensitive and Selective Fluorescent “Turn-On” Probe for Endogenous Detection of HOCl and Reactive Halogenated Species
V. Reut, S. Kozlov, I. Kudryavtsev, N. Grudinina, V. Kostevich, N. Gorbunov, D. Grigorieva, J. Kalvinkovskaya, S. Bushuk, E. Varfolomeeva, N. Fedorova, I. Gorudko, O. Panasenko, V. Vasilyev, A. Sokolov
Antioxidants. , 11, 1719
The actin cytoskeleton regulates exocytosis of all neutrophil granule subsets
N. Jog, M. Rane, G. Lominadze, G. Luerman, R. Ward, K. McLeish
American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2007, 292, C1690-C1700
The Role of Protein Kinase C and [Ca2+]i in Superoxide Anion Synthesis and Myeloperoxidase Degranulation of Human Neutrophils.
J. NAGAJI
The Kurume Medical Journal. 1999, 46, 157-162
Development of Novel Fluorescence Probes That Can Reliably Detect Reactive Oxygen Species and Distinguish Specific Species
K. Setsukinai, Y. Urano, K. Kakinuma, H. Majima, T. Nagano
Journal of Biological Chemistry. 2003, 278, 3170-3175
Use of Flow Cytometry for Quality Evaluation of Biomedical Cell Products
G. Trusov, A. Chaplenko, I. Semenova, E. Melnikova, Y. Olefir
BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. , 18, 16-24