Русский
Тромбоциты – безъядерные клетки крови, размерами 1-4 мкм в диаметре и 0.5-0.75 мкм в толщину. Они играют важную роль в гемостазе, поскольку предотвращают потерю крови при повреждении стенки сосуда [1]. После контакта с поврежденной стенкой тромбоциты активируются, прикрепляются к сосуду и формируют агрегат, который заполняет повреждение.

Процесс агрегации является сложным и включает в себя большое число положительных и отрицательных обратных связей [2]. Вклад большинства из участников был изучен экспериментально [3]–[5]. Для изучения же системы в целом без потери в наблюдении за конкретными компонентами удобным подходом является математическое моделирование.

Существует несколько подходов к моделированию процесса агрегации частиц в целом [6]–[9]. Часто используемой группой подходов являются модели, основанные на законе действующих масс. В частности, модели, основанные на уравнении коагуляции-фрагментации Смолуховского [6], [7], [10], [11]. Такие модели позволяют изучать систему в целом, а также отдельные популяции димеров, тримеров и т.п., однако не могут описать эволюцию роста отдельного агрегата.

Другим широко используемым подходом является использование модели клеточных автоматов, где система представлена ​​сеткой ячеек, имеющих конечное число состояний [8], [12]. Состояние каждой ячейки зависит от состояний соседних ячеек и изменяется в соответствии с определенным набором правил перехода, которые представляют временную эволюцию системы. Модели на основе клеточных автоматов является одним из самых точных, потому что позволяет исследовать физические и биохимические характеристики агрегации на уровне отдельных клеток, однако сильно ограничены размерностью сетки. Для трехмерного пространства или в случае большого количества частиц вычислительные затраты для приемлемой точности решения становятся необоснованно высокими [13]. В результате подход клеточных автоматов в биофизических исследованиях ограничивается исследованием и описанием кластеризации рецепторов или процессов полимеризации [14].

Одним из примеров моделей, основанных на методе клеточных автоматов, а точнее на методе решеток Больцмана (Lattice Boltzmann method) является модель тромбоза, представленная Ouared и Chopard [15]. В данной модели используется приближение неньютоновской жидкости для описания потока крови, а образования сгустка описывается агрегацией эритроцитов, которые представляют собой частицы, добавленные в неньютоновскую жидкость. Данная модель в основном описывает поведение потока и не рассматривает поведение и активацию тромбоцитов.

Подход клеточных автоматов позволяет точно описать процесс агрегации на уровне отдельных агрегатов, а при большом количестве запусков и наборе статистики – оценить поведение системы в целом. Однако, как уже было сказано, главной проблемой является размерность системы. Одним из вариантов решения проблемы является понижение размерности, если для системы данное приближение применимо.

В данной работе представлена двумерная модель на основе клеточного автомата, описывающая процесс агрегации тромбоцитов. Было показано способность применения данного подхода для описания абстрактной системы агрегации тромбоцитов с целью дальнейшего усложнения для описания конкретных систем, таких как кювета агрегометра или описание других постановок агрегации. Данная модель не учитывает другие процессы наблюдаемые in vivo, такие как адгезия или взаимодействия с другими элементами крови и концентрируется только на процессе агрегации тромбоцитов.

 

Метод моделирования
Математическая модель представляет собой двумерное приближение процесса агрегации тромбоцитов. Данный подход обоснован тем, что тромбоциты в основном движутся по линии тока и не имеют собственного направленного движения.

Математическая модель системы реализована на языке программирования С++. Клеточный автомат представляет собой квадратную сетку размером NxN с квадратными ячейками. Соседями ячейки считаются ячейки, находящиеся в ее окрестности Марголуса [16] (8 клеток, имеющие с данной границу по ребру или по углу).

В модели реализованы 4 непустых состояния:

1.     неактивированный тромбоцит

2.     активированный тромбоцит

3.     тромбоцит в агрегате

4.     тромбоцит, отпавший от агрегата

В данной конфигурации заданы 4 процесса:

1.     Случайные блуждания (метод Тоффоли-Марголуса с равновероятным поворотом (ТМ)). В методе ТМ решетка клеточного автомата разбивается на блоки 2х2 двумя способами: «четным» и «нечетным». Правило перехода: каждый из блоков четного разбиения поворачивается на 90° по или против часовой стрелки с равной вероятностью. Затем то же самое проделывается с блоками нечетного разбиения. Данный метод был выбран по двум причинам. Во-первых, показано, что данный алгоритм аппроксимирует оператор Лапласа (ТМ-диффузия при равновероятном повороте по и против часовой стрелки имеет коэффициент 3/2 в правой части уравнения Лапласа). Во-вторых, для него решены модельные задачи, подтверждающие его корректность для моделирования случайных блужданий. Заполненная ячейка при случайном блуждании не может занять место другой заполненной ячейки, что обуславливает закон сохранения частиц (непустых ячеек) в системе. При возникновении такой ситуации тромбоцит не занимает нового места, а остается в состоянии предыдущего шага без возникновения каких-либо дополнительных сил.

2.     Активация.  Ячейки, находящиеся в состоянии 2 или 3 при контакте с ячейкой в состоянии 1 переводят ее в состояние 2 с некоторой вероятностью.

3.     Агрегация одиночных активированных тромбоцитов (состояние 2) и агрегатов (состояние 3) при их контакте. Агрегация в модели означает, что все клетки в агрегате движутся как единое целое (например, при случайных блужданиях все клетки совершают стохастический шаг в одну сторону, общую для всех клеток, а диффузии внутри агрегата (перемещения частиц друг относительно друга) нет. Агрегация и дезагрегация происходят на каждом шаге по времени с вероятностями p = 0.5 и p = 0.025 соответственно. Агрегация с любой ячейкой из окрестности Марголуса происходит с одинаковой вероятностью.  Агрегация может быть между:

a.     Одиночными активированными тромбоцитами (состояние 2)

b.     Одиночными активированными тромбоцитами (состояние 2) и агрегатами (набор соседних ячеек в состоянии 3)

c.      Агрегатами (набор соседних ячеек в состоянии 3)

В каждом из 3 случаев при контакте потенциальных участников агрегации случайно (согласно вероятностям процессов) определяется, произойдёт ли агрегация или нет.

Если агрегация произошла, то ячейки меняют состояние 2 на состояние 3. В дальнейшем агрегат продолжает движение как единое целое.

4.     Дезагрегация. Каждый «крайний» тромбоцит в агрегате может отвалиться от него и перейти в состояние, в котором он никак не взаимодействует с остальными клетками. «Крайний» означает, что у тромбоцита меньше 8 соседей (т.е. любая клетка не из самого центра агрегата может отвалиться). Агрегат из 1 тромбоцита (изолированное состояние 3) также допустим в модели и может распасться. Выход одного тромбоцита из агрегата может привести к распаду этого агрегата на части, если он скреплял эти части.

Кроме базовой конфигурации в модели также реализован гидродинамический поток. На одиночные тромбоциты и агрегаты действует сила вязкого трения. По II закону Ньютона в лабораторной системе отсчета в проекции на ось х (для у аналогично) имеем:

\begin{equation} m \frac{d v_x}{d t}=-6 \pi r \eta\left(v_x-v_x^{f l o w}\right)\tag{1}\end{equation}

где  – масса тромбоцита,  – проекция скорости тромбоцита на ось ,  – радиус тромбоцита,  – вязкость крови,  – проекция скорости потока вдоль оси .      

Численное интегрирование уравнения движения реализовано методом Рунге-Кутта. В простейшем предположении начальные скорости тромбоцитов равны 0, скорости всех агрегатов при их первоначальном образовании также положены равными 0.

В начальный момент времени  сетка заполняется определенным количеством активированных и не активированных тромбоцитов. После этого система эволюционирует во времени согласно заложенным правилам взаимодействия.

Непосредственно на процессы агрегации и дезагрегации гидродинамические силы не влияют (т.к. вероятности являются константами).

Действие механических сил в модели учитывается следующим образом:

1.     Введем для каждого тромбоцита/агрегата скорости (vx(t), vy(t); vx(0) = vy(0) = 0)

2.     Пусть имеем силы Fi(x,y,t)

3.     Запишем II закон Ньютона для частицы (тромбоцита или агрегата)

4.     В каждый момент времени t для каждой частицы:

a.     Численно рассчитаем новые значения скоростей частицы с помощью метода Рунге-Кутты

b.     Изменим координаты частицы на вектор vx*delta_t, vy*delta_t (с учётом округления, т.к. x и y могут принимать только дискретные значения)

В результатах представлена модель, включающая в себя следующие параметры:

1.     Размер сетки 60х60 ячеек

2.     Количество тромбоцитов: 60 штук

3.     Шаг по времени: 0.1 с

4.     Количество шагов в одном запуске: 30

5.     Масса тромбоцита = 1.0

6.     Коэффициент вязкости жидкости = 1.0

7.     Радиус тромбоцита/агрегата = 1.0

В конфигурации с потоком:

1.     Скорость потока вдоль оси y = 10.0

2.     Скорость потока вдоль оси x = 0

3.     Сетка размером 60х60, 50 тромбоцитов (из них изначально активированы 15)

Параметра плотности жидкости в модели нет, т.к. он не фигурирует в формуле для силы вязкого трения, действующей на частицы в модели со стороны гидродинамического потока. Сейчас в модели значения параметров даны в у.е., в дальнейшем планируется привести их в соответствие с литературными данными.

Гидродинамические силы, действующие на агрегаты тромбоцитов, рассчитываются аналогично силам, действующим на одиночные тромбоциты, а именно с помощью закона силы вязкого трения (при этом расчётные параметры имеют те же значения, в т.ч. масса и радиус).

Вероятность агрегации тромбоцита и существующего агрегата, как и все остальные вероятности реакций в модели, является константой. Для всех реакций агрегации эта константа равняется 0.5.

Характерные времена (напр., время симуляции при 30 шагах по модельному времени) для 50/100/200 тромбоцитов ~1/2/3 секунд соответственно, поэтому необходимости применять параллельные вычисления на данный момент нет.

Программная реализация модели включает в себя нумерацию каждого агрегата, что позволяет отслеживать динамику поведение и делает модель масштабируемой для включения новых взаимодействий.

Блок-схема ключевых этапов алгоритма показана на Рис. 1.

Блок-схема ключевых этапов работы алгоритма
Figure 1. Блок-схема ключевых этапов работы алгоритма

Результаты

Корректность диффузии в модели

Эволюция модели главным образом основывается на взаимодействиях/столкновениях частиц, а значит на их передвижении. Изменение координат тромбоцита в модели обусловлено ТМ-диффузией (см. Метод моделирования). Таким образом, корректность поведения системы в целом сильно зависит от правильности введения движущей силы взаимодействий. На Рис. 2 показано, что введенное приближение для диффузии корректно описывает данный процесс. Проверка корректности диффузии производилось на сетке 200х200. Данные представлены для N=5000 запусков и t=200 шагов модельного времени.
Распределение частиц при t = 200. Сторона сетки = 200, число запусков = 5000. Соответствует теоретическому гауссовскому распределению. Среднее значение: 143.8, Стандартное отклонение: 20.2
Figure 2. Распределение частиц при t = 200. Сторона сетки = 200, число запусков = 5000. Соответствует теоретическому гауссовскому распределению. Среднее значение: 143.8, Стандартное отклонение: 20.2
Базовая конфигурация модели без потока

В конфигурации без потока система эволюционирует во времени согласно заложенным взаимодействиям. Типичные результаты моделирование представлены на Рис.3. Видно, что поведение системы не противоречит данным литературы – с течением времени количество агрегатов возрастает, а количество неактивированных тромбоцитов уменьшается [17].

Распределение тромбоцитов в различные моменты времени (0 с; 1 с; 3 с) в базовой конфигурации модели.
Figure 3. Распределение тромбоцитов в различные моменты времени (0 с; 1 с; 3 с) в базовой конфигурации модели.

Модель с потоком

Некоторое количество изначально активированных тромбоцитов необходимо было ввести, т.к. иначе в системе не наблюдалась бы агрегация (поскольку только активированные тромбоциты способны к ней). На данный момент не моделируется какая-либо физиологическая для тромбоцитов ситуация, однако в будущем наиболее перспективными выглядят модели, описывающие:
1.         Кювету агрегометра для in vitro
2.         Поврежденный сосуд для in vivo
Добавление потока ведет к «сносу» тромбоцитов и агрегатов по линии тока. Типичное поведение модели представлено на Рис. 4.
Распределение тромбоцитов в различные моменты времени (0 с; 1 с; 3 с) в конфигурации модели с потоком. Поток направлен вверх по оси y.
Figure 4. Распределение тромбоцитов в различные моменты времени (0 с; 1 с; 3 с) в конфигурации модели с потоком. Поток направлен вверх по оси y.
В конфигурации с потоком получено суммарное распределение числа агрегатов по их размерам. При добавлении потока в модель агрегаты малых размеров (1-3 тромбоцита) составляют большинство в конечном распределении (Рис. 5)  
Суммарное распределение агрегатов по их размерам за N = 5 запусков.
Figure 5. Суммарное распределение агрегатов по их размерам за N = 5 запусков.
Дискуссия

В данной работе была разработана модель клеточных автоматов для описания процесса агрегации тромбоцитов. Результаты моделирования показали, что двумерное приближение способно корректно описать процесс агрегации и отразить основные характерные черты. Полученное распределение агрегатов по размерам хорошо согласуется с ранее опубликованными данными [18] (Fig. S7), а точнее преобладанием димеров в системе.

Двумерное приближение в данном случае обосновано тем, что тромбоциты в основном движутся по линии тока и не имеют собственного направленного движения. Данная модель применима для ламинарного потока крови (то есть без мест турбулентности) в сосуде, а так же может быть использована для описания процесса in vitro в агрегометре светопропускания [19].

Результаты по распределению размеров агрегатов в условиях с и без гидродинамического потока показывают, что добавление потока при всех остальных одинаковых условиях смещает гистограмму распределения размеров. Это может быть связано с тем, что из-за непроницаемой стенки локальная концентрация тромбоцитов увеличивается, что приводит к увеличению событий столкновения и агрегации. Данная конфигурация, возможно, более приближена к ситуации in vivo [20].

Работа показывает обоснованность выбора данного подхода моделирования. Метод клеточных автоматов позволяет усложнять модель и включать действие вторичных активаторов и десенситизацию рецепторов. В дальнейшем планируется более детальное изучение процесса агрегации тромбоцитов и описание экспериментальных постановок, полученных как in vivo, так и in vitro с помощью усложненной модели (аналогично [21]).

Вклад авторов
Разработка концепции, Л. В. Я, А. К. Г.Д., Г. А. В.; методология,  Г. А. В.; программная реализация, Г. А. В.; валидация, Г. А. В.; написание текста, Г. А. В, А.К.Г.Д.; визуализация, Г. А. В., А. К. Д. Г.; Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 21-74-20087.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Библиографические ссылки статьи:

  1. The growing complexity of platelet aggregation

    S. Jackson

    Blood. 2007, 109, 5087-5095

  2. Physiological Positive Feedback Mechanisms

    K. A. Abdel-Sater

    American Journal of Biomedical Sciences. 2011, , 145-155

  3. Aggregation of Blood Platelets by Adenosine Diphosphate and its Reversal

    G. BORN

    Nature. 1962, 194, 927-929

  4. Activation of Platelet Function Through G Protein–Coupled Receptors

    S. Offermanns

    Circulation Research. 2006, 99, 1293-1304

  5. The roles of αIIbβ3-mediated outside-in signal transduction, thromboxane A2, and adenosine diphosphate in collagen-induced platelet aggregation

    M. Cho, J. Liu, T. Pestina, S. Steward, D. Thomas, T. Coffman, D. Wang, C. Jackson, T. Gartner

    Blood. 2003, 101, 2646-2651

  6. Population Balance Modeling of Antibodies Aggregation Kinetics

    P. Arosio, S. Rima, M. Lattuada, M. Morbidelli

    The Journal of Physical Chemistry B. 2012, 116, 7066-7075

  7. Spatially-extended nucleation-aggregation-fragmentation models for the dynamics of prion-like neurodegenerative protein-spreading in the brain and its connectome

    S. Fornari, A. Schäfer, E. Kuhl, A. Goriely

    Journal of Theoretical Biology. 2020, 486, 110102

  8. Models of Solute Aggregation Using Cellular Automata

    L. Kier, C. Cheng, J. Nelson

    Chemistry & Biodiversity. 2009, 6, 396-401

  9. Aggregation kinetics in salt-induced protein precipitation

    T. Przybycien, J. Bailey

    AIChE Journal. 1989, 35, 1779-1790

  10. Toward a Mathematical Model of the Assembly and Disassembly of Membrane Microdomains: Comparison with Experimental Models

    G. Richardson, L. Cummings, H. Harris, P. O’Shea

    Biophysical Journal. 2007, 92, 4145-4156

  11. Development of a Simple Kinetic Mathematical Model of Aggregation of Particles or Clustering of Receptors

    A. Garzon Dasgupta, A. Martyanov, A. Filkova, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Life. 2020, 10, 97

  12. Aggregation dynamics of active cells on non-adhesive substrate

    D. Mukhopadhyay and R. De

    Physical Biology. 2019, ,

  13. synchronous adaptive time step in quantitative cellular automata modeling

    H. Zhu, P. Y. Pang, Y. Sun, and P. Dhar

    BMC Bioinformatics. 2004, 5, 85

  14. Self-Organized Periodicity of Protein Clusters in Growing Bacteria

    H. Wang, N. Wingreen, R. Mukhopadhyay

    Physical Review Letters. 2008, 101, 218101

  15. Lattice Boltzmann Simulations of Blood Flow: Non-Newtonian Rheology and Clotting Processes

    R. Ouared, B. Chopard

    Journal of Statistical Physics. 2005, 121, 209-221

  16. Physics-like models of computation

    N. Margolus

    Physica D: Nonlinear Phenomena. 1984, 10, 81-95

  17. Platelet aggregation: The use of optical density fluctuations to study microaggregate formation in platelet suspension

    Z. Gabbasov, E. Popov, I. Gavrilov, E. Pozin

    Thrombosis Research. 1989, 54, 215-223

  18. Quantitative dynamics of reversible platelet aggregation: mathematical modelling and experiments

    A. Filkova, A. Martyanov, A. Garzon Dasgupta, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Scientific Reports. 2019, 9,

  19. Platelet Aggregometry Testing: Molecular Mechanisms, Techniques and Clinical Implications

    K. Koltai, G. Kesmarky, G. Feher, A. Tibold, K. Toth

    International Journal of Molecular Sciences. 2017, 18, 1803

  20. Platelet Diffusion in Flowing Blood

    V. Turitto, A. Benis, E. Leonard

    Industrial & Engineering Chemistry Fundamentals. 1972, 11, 216-223

  21. Platelet aggregation by laminar shear and Brownian motion

    H. Chang, C. Robertson

    Annals of Biomedical Engineering. 1976, 4, 151-183