Русский

О факторах влияния на исследования сигнализации тромбоцитов с помощью кальциевых флуорофоров

Наблюдение кальциевой сигнализации в тромбоцитах – клеток крови, вовлеченных в остановку кровотечения и формирование кровяных сгустков – важная часть фундаментальных исследований гемостаза. Такие исследования возможны благодаря использованию лишь кальциевых флуорофоров – маленьких молекул, которые проникают через клеточную мембрану благодаря гидрофобной -АМ части, которая затем гилролизуется эстеразами в цитозоле. В этой работе мы предполагаем феномен негомогенной загрузки кальциевых флуорофоров в тромбоциты.

Мы использовали тромбоциты здоровых взрослых доноров, загруженные разными флуоресцентными красками (CalBryte590, DiOC6 (3), Fura Red, Fluo-4 and CellTracker Violet BMQC) и иммобилизованные на антитела к CD31 в плоскопараллельных проточных камерах. Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) была использована.

Мы продемонстрировали, что все исследуемые краски загружались гетерогенно: 30% тромбоцитов загружались в тромбоциты в 2-6 раз выше, чем медианное значение по популяции. Используя CalBryte590 как пример, мы показали, что снижение температуры инкубации, добавление Pluronic 127 в среду, удаление холестерола из мембраны значительно снижает гетерогенность распределения краски в популяции. Оценивая активацию тромбоцитов на поверхности, мы показали, что вероятность наблюдения сильной активации, измеренная по интенсивности осцилляций кальция, коррелирует с количеством краски в тромбоците. Таким образом, мы заключаем, что тип используемого флуорофора и условия его загрузки может значимо влиять на результаты экспериментов по наблюдению кальциевой сигнализации в тромбоцитах.

null
3 253
0
#тромбоциты#кальциевые флуорофоры#мембрана#флуоресцентные краски#внутриклеточная сигнализация

Иммунная тромбоцитопения: что может предложить системная биология и системная физиология?

, ,

Иммунная тромбоцитопения (ИТП) – приобретенное аутоиммунное заболевание. Причины ИТП могут быть связаны с другими заболеваниями (вирусными, бактериальными или системными), или ИТП может развиваться без видимой на то причины. В то время как механизмы дисрегуляции иммунной системы при ИТП описаны, этиология заболевания остается непонятной. Кроме того, все существующие подходы к лечению неспецифичны для ИТП, и эффект терапии пациент-специфичен. В этой работе мы описываем предполагаемые причины и механизмы развития ИТП и обсуждаем новейшие экспериментальные и теоретические подходы к диагностике ИТП и предсказанию эффективности терапии.

null
4 201
0
#аутоиммунитет#ИТП#тромбоциты#острая/хроническая ИТП#компьютерное моделирование#мышиные модели

Функциональные ответы тромбоцитов и внутриклеточная сигнализация: молекулярные взаимоотношения. Часть 2: Рецепторы

Маленькие безъядерные клетки, тромбоциты, в основном предназначены для образования агрегатов при повреждении сосудов, что позволяет остановить кровотечение. Для выполнения этой функции, тромбоциты способны реализовывать ряд функциональных ответов, индуцируемых различными агонистами и координируемых сложной сетью внутриклеточной сигнализации, запускаемой десятком разнообразных рецепторов. Настоящий обзор, второй из серии, описывает известные пути внутриклеточной сигнализации, индуцируемые тромбоцитарными рецепторами в ответ на канонические и редкие агонисты. Особый фокус будет сделан на точках взаимодействия и «синергии» путей активации тромбоцита, и промежуточных или «вторичных» посредниках активации, передающих сигнал к функциональным проявлениям.

Разные степени активации тромбоцитов при гемостазе. При слабой активации тромбоциты переходят в слабоактивированное состояние, при котором не происходит кластеризации тромбоцитарных интегринов и значимое изменение формы тромбоцитов. Данная слабая активация является обратимой и соответствует состоянию тромбоцитов в «шубе» тромба. При более сильной активации происходит значительное изменение формы, необратимая активация и агрегация тромбоцитов. Также происходит секреция тромбоцитарных гранул. При максимальной степени активации происходит коллапс митохондрий тромбоцитов и тромбоциты переходят в прокоагулянтное состояние, выставляя фосфатидилсерин. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты значительно ускоряют плазменное звено гемостаза.
14 366
0
#тромбоциты#внутриклеточная сигнализация#физиология

Существует значимая корреляция между гиперактивацией тромбоцитов и их потреблением при COVID-19. Пилотное исследование на пациентах из больницы ЦКБ РАН (г. Троицк)

, , , , , , , ,

Известно, что при COVID-19 избыточная свёртываемость крови и, иногда, тромбоцитопения, могут быть характерными для тяжёлого течения заболевания. При этом роль тромбоцитов в патогенезе COVID-19 весьма противоречива. В рамках настоящего исследования нашей задачей было определение степени гиперактивации тромбоцитов пациентов с COVID-19. В исследовании была использована проточная цитометрия цельной крови, окрашенной аннексином-V и лактадгерином («PS + тромбоциты»). Также была разработана стохастическая математическая модель производства и потребления тромбоцитов. Экспериментально было показано, что процент PS + тромбоцитов у пациентов с COVID-19 был в два раза выше, чем у здоровых доноров. При это была получена статистически значимая корреляция между количеством PS+ тромбоцитов и процентом повреждения легких у пациентов. Не было обнаружено никакой связи между гибелью тромбоцитов и терапией пациентов в стационарах. Доля PS+ тромбоцитов была повышена только у пациентов с хроническими заболеваниями лёгких. Хотя у пациентов не наблюдалось выраженных тромбоцитопений, наблюдаемое увеличение размера тромбоцитов (параметр FSC-A в проточной цитометрии) может указывать на то, что возраст тромбоцитов у пациентов был снижен. Разработанная компьютерная модель производства-утилизации тромбоцитов подтверждает возможность интенсивного потребления тромбоцитов без значимых изменений их количества. Таким образом, можно заключить, что наблюдаемая гиперактивация тромбоцитов при COVID-19 может быть вызвана активацией тромбоцитов в кровотоке, что приводит к их потреблению, но не вызывает значительную тромбоцитопению.

Компьютерная модель производства и потребления тромбоцитов при тромбозе, вызванном COVID-19. A - Подробная схема модели (наиболее чувствительные реакции выделены красным). B - Зависимость среднего количества тромбоцитов (зеленая кривая и точки) и размера тромбоцитов (красная кривая и точки) от индекса потребления тромбоцитов в модели. Количество и размер тромбоцитов при отсутствии потребления находятся в областях, выделенных зеленым и красным прямоугольниками соответственно. C - Распределение тромбоцитов по размеру при отсутствии (зеленые столбцы) и наличии (красные столбцы) потребления (с индексом потребления, установленным на 2). Усы на всех графиках представляют SD.
10 294
0
#КОВИД-19#тромбоциты#свертывание#воспаление#гиперактивация

Современные подходы к моделированию тромбоза и гемостаза in vitro

Нарушения в работе системы гемостаза отвечают за большое количество жизнеугрожающих состояний, однако несмотря на многие десятилетия исследований, на сегодняшний день не существует надежных способов корректировать состояние гемостаза без значимых рисков развития тромбозов или кровотечений. Данная ситуация отражает недостаточный уровень понимания ключевых механизмов, которые регулируют гемостатический ответ в норме и при патологии. Для развития фундаментальных представлений о принципах регуляции гемостаза сегодня активно применяются как экспериментальные модели, так и теоретические подходы. Данный обзор посвящен современным in vitro моделям тромбоза и гемостаза и фокусируется на ключевых подходах и инструментах, используемых для изучения процесса свертывания крови вне организма человека. Для воссоздания данного процесса сегодня активно применяются технологии микрофлюидики, а также походы к созданию искусственных сосудов на основе разнообразных гидрогелей. In vitro модели тромбоза традиционно имитируют непроникающие повреждения сосудистой стенки в условиях потока крови и уже более 30 лет исследуются для изучения ключевых процессов, отвечающих за формирование артериальных тромбов – патологических сгустков, которые могут привести к значительному уменьшению кровоснабжения жизненно важных органов. Модели гемостаза in vitro получили активное развитие лишь в последние годы и фокусируются на установлении важных закономерностей образования гемостатических пробок – сгустков, блокирующих кровопотерю в случае проникающего повреждения сосуда. Современные in vitro модели тромбоза и гемостаза используются не только как инструменты для фундаментальных исследований, но и в ряде случаев внедряются в клиническую практику в качестве интегральных методов диагностики нарушений гемостаза.

Создание PDMS-камеры: а) Мастер форму готовят с использованием фотолитографии. Рельеф (обычно сделанный из фоторезистора на кремниевой пластине, показано оранжевым) обычно содержит несколько паттернов для печати на PDMS; b) Рельефную форму (мастер форму) заливают жидкой смесью из основы PDMS с затвердителем; c-d) Часть полимеризованного PDMS затем отрезается и удаляется из формы, e) делаются отверстия для втока и вытока, и присоединяются необходимые трубки. Камера прикрепляется к стеклянному или пластиковому покровному стеклу (серое) с помощью плазменной сварки или вакуумной герметизации.
6 358
0
#гемостаз#тромбоциты#микрофлюидика#гидрогель#цельная кровь#in vitro модели#тромбоз

Прямое взаимодействие STIM1-ORAI1 не может управлять депо-управляемым входом кальция (SOCE) в тромбоцитах

Депо-управляемый вход кальция (SOCE) играет важную роль в функционировании тромбоцитов. Считается, что механизм SOCE основан на прямом взаимодействии белков STIM1 и ORAI1 со специфической стехиометрией STIM1:ORAI1. Однако в тромбоцитах может осуществляться другой путь. Целью данной работы было исследование механизмов SOCE в тромбоцитах. Мы разработали решеточную математическую модель, которая отражает взаимодействие STIM1-ORAI1, и применили ее как к клеткам HEK, где механизм SOCE хорошо установлен, так и к тромбоцитам. Модель смогла успешно описать поведение STIM1-ORAI1 в клетках HEK. Мы использовали те же параметры для взаимодействия белков и применили их к тромбоцитам. В результате мы продемонстрировали, что количество белков STIM1 на мембране ЭПР не может обеспечить необходимую стехиометрию для правильного депо-управляемого входа кальция в тромбоцитах.

(A) Взаимодействие STIM1-ORAI1 для клеток HEK. Связанные белки представлены коричневым цветом, STIM1 в кластере - зеленым, свободные белки - красным. (B) Зависимость формирования контакта STIM1-ORAI1 от вероятности кластеризации. Пунктирные линии представляют тот же процесс для D=0.01 〖μm〗^2/s (C) Типичное состояние системы при t=100ms для различных вероятностей кластеризации.
5 566
0
#тромбоциты#математическое моделирование#депо-зависимый вход кальция#внутриклеточная сигнализация тромбоцита

Поиск по ключевым словам
#platelets

Найдено 14 статей