Русский

София Галкина

О факторах влияния на исследования сигнализации тромбоцитов с помощью кальциевых флуорофоров

Наблюдение кальциевой сигнализации в тромбоцитах – клеток крови, вовлеченных в остановку кровотечения и формирование кровяных сгустков – важная часть фундаментальных исследований гемостаза. Такие исследования возможны благодаря использованию лишь кальциевых флуорофоров – маленьких молекул, которые проникают через клеточную мембрану благодаря гидрофобной -АМ части, которая затем гилролизуется эстеразами в цитозоле. В этой работе мы предполагаем феномен негомогенной загрузки кальциевых флуорофоров в тромбоциты.

Мы использовали тромбоциты здоровых взрослых доноров, загруженные разными флуоресцентными красками (CalBryte590, DiOC6 (3), Fura Red, Fluo-4 and CellTracker Violet BMQC) и иммобилизованные на антитела к CD31 в плоскопараллельных проточных камерах. Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF) была использована.

Мы продемонстрировали, что все исследуемые краски загружались гетерогенно: 30% тромбоцитов загружались в тромбоциты в 2-6 раз выше, чем медианное значение по популяции. Используя CalBryte590 как пример, мы показали, что снижение температуры инкубации, добавление Pluronic 127 в среду, удаление холестерола из мембраны значительно снижает гетерогенность распределения краски в популяции. Оценивая активацию тромбоцитов на поверхности, мы показали, что вероятность наблюдения сильной активации, измеренная по интенсивности осцилляций кальция, коррелирует с количеством краски в тромбоците. Таким образом, мы заключаем, что тип используемого флуорофора и условия его загрузки может значимо влиять на результаты экспериментов по наблюдению кальциевой сигнализации в тромбоцитах.

null
4 454
0
#тромбоциты#кальциевые флуорофоры#мембрана#флуоресцентные краски#внутриклеточная сигнализация