Русский

Современные подходы к моделированию тромбоза и гемостаза in vitro

Список сокращений:

PDMS — polydimethylsiloxane

HUVEC — Human Umbilical Vein Endothelial Cells

СFD – computational fluid dynamics

TF - tissue factor

GelMA - methacrylate-gelatin

Введение

На сегодняшний день система гемостаза человека остается предметом активных исследований в первую очередь из-за большой клинической значимости: одни только осложнения, вызванные артериальным тромбозом, являются наиболее распространенной причиной смерти и инвалидности людей в развитых странах

. Ключевыми методами исследования физиологии гемостаза на сегодняшний день остаются животные in vivo модели
[
2
Murine Models of Vascular Thrombosis

R. Westrick, M. Winn, D. Eitzman

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007, 27, 2079-2093

]
, а также in vitro
[
4,
The use of microfluidics in hemostasis

K. Neeves, A. Onasoga, A. Wufsus

Current Opinion in Hematology. 2013, 20, 417-423

5,
Subcommittee on Biorheology. In vitro flow‐based assay: From simple toward more sophisticated models for mimicking hemostasis and thrombosis.

5. Mangin PH, Neeves KB, Lam WA, Cosemans JM, Korin N, Kerrigan SW, Panteleev MA

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2021, 19, 582-7

]
и in silico
[
6
In Silico Hemostasis Modeling and Prediction

D. Nechipurenko, A. Shibeko, A. Sveshnikova, M. Panteleev

Hämostaseologie. 2020, 40, 524-535

]
подходы.

In vitro модели позволяют реконструировать процессы гемостатического ответа вне организма в хорошо контролируемых условиях, что представляет особую ценность ввиду чрезвычайной сложности устройства системы гемостаза. Такие модели также представляют большую ценность как потенциальные системы для оценки состояния гемостаза в клинических и амбулаторных условиях, а также как инструменты для разработки новых лекарственных препаратов, так как позволяют работать с кровью людей. 

В данном обзоре дается современный срез наиболее значимых по мнению авторов in vitro подходов, предложенных в последние годы для исследования тромбоза и гемостаза. В соответствие с традиционными представлениями, структура данной работы подразумевает разделение моделей тромбоза, которые имитируют формирование внутрисосудистых сгустков, и моделей гемостаза, которые ставят своей целью реконструировать процессы, происходящие при проникающем повреждении сосуда и в норме приводящие к быстрой остановке кровопотери.

В нашей работе мы будем фокусироваться в большей степени на технологических аспектах устройства таких моделей, нежели на биологических или клинических результатах, полученных с их помощью.

In vitro модели тромбоза

Модели микрофлюидики

Одним из наиболее популярных и зарекомендовавших себя подходов к созданию проточных камер для моделирования тромбоза сегодня является использование PDMS в качестве материальной основы, формирующей геометрию каналов. Прозрачность PDMS, его биологическая инертность, а также прекрасное сочетание с технологией фотолитографии, привели к бурному развитию микрофлюидики и ее активному применению в различных задачах биологии и медицины. Применение этой технологии для воссоздания процесса свертывания крови вне организма позволяет регулировать значительную часть параметров эксперимента: геометрию канала или сосуда, давление в канале, скорость потока и скорость сдвига, расположение активатора, инициирующего образование тромба, введение различных растворов в систему. Для создания такой проточной камеры, как правило, используются так называемые микрофлюидные чипы - cпроектированные и созданные методами фотолитографии формы для заливки, определяющие геометрию создаваемых каналов. Тандем фотолитографии и полимеризующегося эластомера (PDMS) получил название мягкой литографии и представлен на Рис.1.

Создание PDMS-камеры: а) Мастер форму готовят с использованием фотолитографии. Рельеф (обычно сделанный из фоторезиста на кремниевой пластине, показано оранжевым) обычно содержит несколько паттернов для печати на PDMS; b) Рельефную форму (мастер форму) заливают жидкой смесью из основы PDMS с затвердителем; c-d) Часть полимеризованного PDMS затем отрезается и удаляется из формы, e) делаются отверстия для втока и вытока, и присоединяются необходимые трубки. Камера прикрепляется к стеклянному или пластиковому покровному стеклу (серое) с помощью плазменной сварки или вакуумной герметизации.
Figure 1. Создание PDMS-камеры: а) Мастер форму готовят с использованием фотолитографии. Рельеф (обычно сделанный из фоторезиста на кремниевой пластине, показано оранжевым) обычно содержит несколько паттернов для печати на PDMS; b) Рельефную форму (мастер форму) заливают жидкой смесью из основы PDMS с затвердителем; c-d) Часть полимеризованного PDMS затем отрезается и удаляется из формы, e) делаются отверстия для втока и вытока, и присоединяются необходимые трубки. Камера прикрепляется к стеклянному или пластиковому покровному стеклу (серое) с помощью плазменной сварки или вакуумной герметизации.

К ключевым параметрам экспериментов по тромбообразованию в условиях потока можно отнести: геометрию канала (форма, характерный размер), пристеночную скорость сдвига (как правило варьируется в диапазоне от 100 до 2000 с-1), биохимический состав и геометрию области с активатором тромбообразования (как правило используется фибриллярный коллаген первого типа и тканевый фактор), источник и состав крови (организм, из которого взята кровь, тип антикоагулянтов, наличие дополнительных веществ в крови).

Примером изящного применения технологии микрофлюидики для изучения тромбообразования и молекулярных механизмов, ответственных за определенные этапы формирования тромбов является классическая работа исследователей из Университета Пенсильвании

. Данный подход, за счет использования крови мышей дикого типа и различных нокаутных линий, позволяет оценивать вклад определенных рецепторов тромбоцитов в процесс тромбообразования в контролируемых гемодинамических условиях. Для существенного уменьшения объемов используемой крови исследователи значительно уменьшили геометрические размеры каналов (100 на 100 микрометров), что стало возможным благодаря использованию технологии фотолитографии. Для инициации процесса тромбообразования авторами использовался наиболее широко применяемый активатор - фибриллярный коллаген первого типа, наносимый на предварительно очищенное предметное стекло при помощи микрофлюидного канала. Подобная методика предполагает вакуумное присоединение камеры из PDMS с единственным каналом, проходящим по всей длине предметного стекла (Рис. 2, a, b). Такой подход к созданию проточной камеры позволяет проводить эксперименты для различных пристеночных скоростей сдвига в пределах одной камеры с постоянной геометрией, регулировать область имитируемого повреждения, а также зафиксировать неизменными для серии экспериментов положение, размер и концентрацию активатора.

Использование проточных камер из PDMS также позволяет создавать проточные системы со сложной геометрией. Исследователи во главе со Скоттом Л. Даймондом продемонстрировали применение разработанного ими микрофлюидного устройства, позволяющего прокачивать флуоресцентное растворенное вещество через растущий тромб, образующийся на коллагене ± тканевом факторе, при независимом контроле градиента давлений и скорости сдвига

. Микрофлюидное устройство также создавалось при помощи техники мягкой литографии и было закреплено на предметном стекле при помощи вакуумируемого контура. Геометрия устройства включает несколько входов и выходов, дополнительное сопротивление, а также домены для контроля и мониторинга давления (Рис. 2, c, f). Подобная система позволяет варьировать большое количество степеней свободы модели, при этом точно фиксируя важные гемодинамические параметры — давление и скорость сдвига. Отличительной чертой данной системы была геометрия расположения активаторов и тромба по отношению к объективу микроскопа: в отличие от классических систем, в которых тромбообразование происходит на одной из горизонтальных плоскостей проточной системы, в данной модели рост тромба инициировался на вертикальных стенках и распространялся в горизонтальной плоскости вглубь канала (Рис. 2, f), что позволяло исследователям наблюдать внутреннюю структуру тромба не делая оптические срезы, как в классических экспериментах.

Микрофлюидные устройства для анализа формирования тромба под управляемым сдвигом. a) Лента коллагена размером 100 мкм (красная) была помещена и иммобилизирована с микрофлюидным рисунком по длине предметного стекла. b) Микрофлюидное устройство с набором каналов было ориентировано перпендикулярно коллагеновому рисунку (красный). Адаптировано из [7]. c-e) Микрофлюидное устройство с регулируемым градиентом давления. Постоянный поток Q1 обеспечивался шприцевым насосом. Наличие датчиков давления (P1, P2 и P3) и дополнительного втока Q2 позволило контролировать градиент давления в зоне формирования тромба. (e, f). f) Тромб (оранжевый) сформирован на коллагене (синий), располагаясь между столбиками PDMS (белые круги). Адаптировано из [8].
Figure 2. Микрофлюидные устройства для анализа формирования тромба под управляемым сдвигом. a) Лента коллагена размером 100 мкм (красная) была помещена и иммобилизирована с микрофлюидным рисунком по длине предметного стекла. b) Микрофлюидное устройство с набором каналов было ориентировано перпендикулярно коллагеновому рисунку (красный). Адаптировано из [7]. c-e) Микрофлюидное устройство с регулируемым градиентом давления. Постоянный поток Q1 обеспечивался шприцевым насосом. Наличие датчиков давления (P1, P2 и P3) и дополнительного втока Q2 позволило контролировать градиент давления в зоне формирования тромба. (e, f). f) Тромб (оранжевый) сформирован на коллагене (синий), располагаясь между столбиками PDMS (белые круги). Адаптировано из [8].

Модели, основанные на использовании гидрогеля

Наиболее часто используемые подходы к конструированию микрофлюидных камер удобны в использовании, но степень соответствия реальному сосуду достаточно низкая: нефизиологичная геометрия (прямоугольное/квадратное сечение каналов), отсутствие эндотелиальных клеток, механически жесткие стенки из PDMS. Наиболее реалистичные модели сосудов на сегодняшний день создаются на основе объединения технологии гидрогелей и методов культивирования клеток – такие системы все чаще используются для самых разных биомедицинских задач

.

Ю Шрайк Чжан et al. использовали технологию 3D-биопечати для создания высокобиомиметической модели тромбоза

[
12
Bioprinted thrombosis-on-a-chip

Y. Zhang, F. Davoudi, P. Walch, A. Manbachi, X. Luo, V. Dell'Erba, A. Miri, H. Albadawi, A. Arneri, X. Li, X. Wang, M. Dokmeci, A. Khademhosseini, R. Oklu

Lab on a Chip. None, 16, 4097-4105

]
. Тело камеры было выполнено из гидрогеля - метакрилат-желатина (GelMA), на основе которого были изготовлены три типа каналов: микроканалы, покрытые HUVEC без фибробластов; неэндотелиализированные микроканалы с инкапсулированными фибробластами в гидрогеле и эндотелиализированные микроканалы с одновременно инкапсулированными внутри фибробластами (Рис. 3, a, c). Таким образом, использование гидрогелей и технология биопечати позволяют получить модели сосудов с высокой степенью подобия реальным сосудам как с точки зрения механических свойств, так и по биохимическому составу клеточной стенки.

Другой популярный подход к дизайну реалистичного сосуда основан на технике удаления капилляров (Рис. 3, d-f) и успешно применяется для решения разнообразных задач

.

Разные подходы к использованию гидрогелей для имитации искусственных сосудов. a) – c): биопечать васкуляризированных гидрогелей, схема процесса биопечати (адаптировано из [12]). a) биопечать сосудов и стенки; b) основа для GelMA; c) финальное блокирование GelMA после затвердевания под действием ультрафиолетового света и растворение дополнительного слоя (сделанного из плюроника). d) – f): 3D микрососуд, сделанный из ткани, схем процесса конструирования: d) PDMS форма, которая содержит отверстия для втока и вытока, прикреплена вакуумом к стеклу и выступает в роли оболочки. Цилиндрический стержень шаблона (например, стеклянный капилляр) расположен в середине камеры внутри специальных функциональных отверстий; e) PDMS форма заполнена гидрогелем в жидком состоянии; f) после желирования стержень физически удаляется, вытягивая его с одного конца. После удаления стержня шаблона камера готова к использованию для перфузии крови/плазмы или может использоваться для посадки и культивации эндотелиальных клеток. Адаптировано из [9].
Figure 3. Разные подходы к использованию гидрогелей для имитации искусственных сосудов. a) – c): биопечать васкуляризированных гидрогелей, схема процесса биопечати (адаптировано из [12]). a) биопечать сосудов и стенки; b) основа для GelMA; c) финальное блокирование GelMA после затвердевания под действием ультрафиолетового света и растворение дополнительного слоя (сделанного из плюроника). d) – f): 3D микрососуд, сделанный из ткани, схем процесса конструирования: d) PDMS форма, которая содержит отверстия для втока и вытока, прикреплена вакуумом к стеклу и выступает в роли оболочки. Цилиндрический стержень шаблона (например, стеклянный капилляр) расположен в середине камеры внутри специальных функциональных отверстий; e) PDMS форма заполнена гидрогелем в жидком состоянии; f) после желирования стержень физически удаляется, вытягивая его с одного конца. После удаления стержня шаблона камера готова к использованию для перфузии крови/плазмы или может использоваться для посадки и культивации эндотелиальных клеток. Адаптировано из [9].

Плоско-параллельные проточные камеры

Следует отметить, что проточные камеры плоскопараллельной геометрии несмотря на свою простоту активно и успешно используются для фундаментальных исследований системы гемостаза и сегодня

[
13,
Pharmacological Blockade of Glycoprotein VI Promotes Thrombus Disaggregation in the Absence of Thrombin

M. Ahmed, V. Kaneva, S. Loyau, D. Nechipurenko, N. Receveur, M. Le Bris, E. Janus-Bell, M. Didelot, A. Rauch, S. Susen, N. Chakfé, F. Lanza, E. Gardiner, R. Andrews, M. Panteleev, C. Gachet, M. Jandrot-Perrus, P. Mangin

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2127-2142

14,
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

15,
Core and shell platelets of a thrombus: A new microfluidic assay to study mechanics and biochemistry

M. DeCortin, L. Brass, S. Diamond

Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2020, 4, 1158-1166

16,
Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Blood. 2016, 128, 1745-1755

17
Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow

F. Swieringa, C. Baaten, R. Verdoold, T. Mastenbroek, N. Rijnveld, K. van der Laan, E. Breel, P. Collins, M. Lancé, Y. Henskens, J. Cosemans, J. Heemskerk, P. van der Meijden

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2016, 36, 692-699

]
. Эти камеры сконструированы с использованием и технологии микрофлюидики, и более простых подходов (например, разрезав канал на липкой ленте, которую затем помещают между покровными стеклами или их аналогами).

Исследователи из Маастрихтского университета, используя стандартную проточную камеру с плоскопараллельной геометрией, продемонстрировали возможность бесклеточных гомогенатов из человеческих атеросклеротической бляшек способствовать адгезии тромбоцитов и образованию агрегатов в условиях относительно высоких скоростей сдвига (1000 с-1)

[
18
Contribution of platelet glycoprotein VI to the thrombogenic effect of collagens in fibrous atherosclerotic lesions

J. Cosemans, M. Kuijpers, C. Lecut, S. Loubele, S. Heeneman, M. Jandrot-Perrus, J. Heemskerk

Atherosclerosis. 2005, 181, 19-27

]
. Данная работа позволила сравнить тромбогенный потенциал стандартных активаторов (в том числе фибриллярного коллагена первого типа) с многокомпонентной смесью из активаторов, выделяемой из атеросклеротических бляшек пациентов. Идея сравнения тромбообразования на различных активаторах и их комбинациях была в дальнейшем выведена авторами на новый уровень: при помощи технологии микропечати был проведен анализ тромбообразования на более чем 50 различных поверхностях
[
19
Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation

S. de Witt, F. Swieringa, R. Cavill, M. Lamers, R. van Kruchten, T. Mastenbroek, C. Baaten, S. Coort, N. Pugh, A. Schulz, I. Scharrer, K. Jurk, B. Zieger, K. Clemetson, R. Farndale, J. Heemskerk, J. Cosemans

Nature Communications. 2014, 5, None

]
в стандартных камерах плоскопараллельной геометрии.

Модели со стенотической геометрией

Для изучения влияния эффекта резкого изменения потока на динамику тромбообразования используют проточные камеры с особой геометрией: в стандартную форму проточной камеры добавляется возмущение, влияющее на распределение скорости сдвига. Подобная геометрия позволяет изучать характер образования тромба при пространственном изменении скорости сдвига более чем на порядок.

Создание стенотической геометрии может быть реализовано также путем имитации атеросклеротической геометрии полуокружностью

[
20
Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner

E. Westein, A. van der Meer, M. Kuijpers, J. Frimat, A. van den Berg, J. Heemskerk

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013, 110, 1357-1362

]
или созданием локального возмущения, предназначенного для резкого увеличения скорости сдвига до 1800 с–1 в сочетании с немедленным замедлением сдвига до 200 с–1
[
21
A shear gradient–dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation

W. Nesbitt, E. Westein, F. Tovar-Lopez, E. Tolouei, A. Mitchell, J. Fu, J. Carberry, A. Fouras, S. Jackson

Nature Medicine. 2009, 15, 665-673

]
. Используя камеры, имитирующие стеноз, было показано, как градиенты скорости сдвига способствуют двухфазному образованию тромба на слабых адгезивных белках, таких как фибриноген, зависимым от фактора фон Виллебранда образом
[
22
Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen in a von Willebrand factor-dependent manner.

Receveur, Nicolas, Dmitry Nechipurenko, Yannick Knapp, Aleksandra Yakusheva, Eric Maurer, Cécile V. Denis, François Lanza, Mikhail Panteleev, Christian Gachet, and Pierre H. Mangin.

Haematologica. 2020, 105, None

]
. Конструкция стандартной плоскопараллельной проточной камеры была модифицирована для возможности проводить сравнение двух каналов: прямого и стенозированного (уменьшение области просвета сосуда на 90%, Рис. 4).

Схема микрофлюидной проточной камеры, разработанной для создания градиентов сдвига. (a) Схема полидиметилсилоксановой (PDMS) проточной камеры, содержащей прямоугольный канал шириной 1 мм и высоток 0,1 мм и стенотический канал с такими же измерениями, но уменьшенный на 90% по ширине в центральной области (зона 3). Зоны 1-5 обозначены в нижней части схем, показывающих 3D вид. (b) Микрофотография микрофлюидной проточной камеры с флуоресцентного микроскопа: переход от зоны 2 к зоне 3 стенотического канала. Изображение было получено с увеличением х20. (c) Карта величины скорости на средней высоте стенотического канала, полученная с использованием скоростной съемки микрочастиц: переход от зоны 2 к зоне 3. (d) Безразмерные профили скорости U/Umax как функция Y/Ymax или Z/Zmax (U – величина скорости, Ymax – полуширина стеноза, Zmax – полувысота) на средней высоте и средней ширине микрофлюидной проточной камеры в зоне 3. (e) Вычислительный анализ гидродинамики, представляющий скорость сдвига в нижней части камеры (z = 0) по всей камере и в увеличенной области, соответствующий входу в зону 3. Геометрия канала в модели вычислительной гидродинамики (CFD) соответствовала стенотической версии камеры, показанная на панели (а). Рисунок адаптирован из [20].
Figure 4. Схема микрофлюидной проточной камеры, разработанной для создания градиентов сдвига. (a) Схема полидиметилсилоксановой (PDMS) проточной камеры, содержащей прямоугольный канал шириной 1 мм и высоток 0,1 мм и стенотический канал с такими же измерениями, но уменьшенный на 90% по ширине в центральной области (зона 3). Зоны 1-5 обозначены в нижней части схем, показывающих 3D вид. (b) Микрофотография микрофлюидной проточной камеры с флуоресцентного микроскопа: переход от зоны 2 к зоне 3 стенотического канала. Изображение было получено с увеличением х20. (c) Карта величины скорости на средней высоте стенотического канала, полученная с использованием скоростной съемки микрочастиц: переход от зоны 2 к зоне 3. (d) Безразмерные профили скорости U/Umax как функция Y/Ymax или Z/Zmax (U – величина скорости, Ymax – полуширина стеноза, Zmax – полувысота) на средней высоте и средней ширине микрофлюидной проточной камеры в зоне 3. (e) Вычислительный анализ гидродинамики, представляющий скорость сдвига в нижней части камеры (z = 0) по всей камере и в увеличенной области, соответствующий входу в зону 3. Геометрия канала в модели вычислительной гидродинамики (CFD) соответствовала стенотической версии камеры, показанная на панели (а). Рисунок адаптирован из [20].

Разное: помимо традиционных задач и техник

В ряде работ подходы микрофлюидики также успешно применялись для анализа процессов полимеризации фибрина в условиях потока, но в отсутствие тромбоцитов

[
24
Thrombin generation and fibrin formation under flow on biomimetic tissue factor-rich surfaces

A. Onasoga-Jarvis, T. Puls, S. O'Brien, L. Kuang, H. Liang, K. Neeves

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2014, 12, 373-382

]
.

В большинстве существующих моделей тромбоза поток в системе поддерживается постоянным за счет использования шприцевых насосов. Очевидно, условия постоянного потока не являются физиологически корректными, поэтому в ряде моделей исследователи используют специальные шунтирующие каналы, тем самым реализуя условия квазистационарного перепада давления

[
25,
Impact of Tissue Factor Localization on Blood Clot Structure and Resistance under Venous Shear

V. Govindarajan, S. Zhu, R. Li, Y. Lu, S. Diamond, J. Reifman, A. Mitrophanov

Biophysical Journal. 2018, 114, 978-991

26
Dynamics of Blood Flow and Thrombus Formation in a Multi-Bypass Microfluidic Ladder Network

J. Zilberman-Rudenko, J. Sylman, H. Lakshmanan, O. McCarty, J. Maddala

Cellular and Molecular Bioengineering. 2017, 10, 16-29

]
. Постоянство скорости сдвига также не является корректным на малых временах порядка сердечного цикла: в артериях эффекты пульсаций могут быть существенными, поэтому в ряде моделей исследователи использовали специальные системы для создания эффекта пульсаций
[
27,
High Shear Thrombus Formation under Pulsatile and Steady Flow

L. Casa, D. Ku

Cardiovascular Engineering and Technology. 2014, 5, 154-163

28
The influence of the pulsatility of the blood flow on the extent of platelet adhesion.

Zhao XM, Wu YP, Cai HX, Wei R, Lisman T, Han JJ, Xia ZL, de Groot PG

Thrombosis research. 2008, 121, 821-5

]
.

Для обеспечения перфузии жидкости через камеру обычно используются либо шприцевые насосы, либо гидростатическое давление, однако недавно была предложена камера ex vivo с автоперфузией, предназначенная для изучения поведения лейкоцитов и тромбоцитов мышей в четко определенных гемодинамических условиях

[
29
A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function

A. Hafezi-Moghadam, K. Thomas, C. Cornelssen

American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2004, 286, C876-C892

]
. В этой модели сердце мыши непрерывно управляет потоком крови через камеру, обеспечивая широкий диапазон физиологических скоростей сдвига. Таким образом, камера ex vivo представляет собой внешний сосуд, соединяющий артериальную и венозную системы живой мыши, то есть сердце животного создает движущую силу кровообращения.

Изучение тромбообразования в условиях потока крови в большинстве случаев сфокусировано на исследовании процессов, которые могут происходить в случае непроникающего повреждения внутреннего слоя сосудистой стенки над атеросклеротической бляшкой и, таким образом, соответствует артериальному тромбозу. Другим патологическим сценарием тромбообразования является формирование так называемых красных венозных тромбов в области застойных зон вблизи венозных клапанов. Для моделирования этого процесса была предложена специальная микрофлюидная проточная камера, в которой за счет подбора геометрических и гемодинамических параметров формируется застойная зона, имитирующая ситуацию в живом организме

[
30
Platelets Drive Thrombus Propagation in a Hematocrit and Glycoprotein VI–Dependent Manner in an In Vitro Venous Thrombosis Model

M. Lehmann, R. Schoeman, P. Krohl, A. Wallbank, J. Samaniuk, M. Jandrot-Perrus, K. Neeves

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2018, 38, 1052-1062

]
.

На сегодняшний день in vitro модели тромбоза значительно чаще применяются в фундаментальных исследованиях, чем в клинической практике, что связано главным образом с проблемами стандартизации таких систем. Несмотря на это, в последние годы проточные камеры все чаще используются для диагностики и изучения нарушений в работе системы гемостаза, а также для мониторинга антиагрегантной терапии

.

In vitro модели гемостаза

Одна из первых моделей гемостаза, описанных в литературе, была предложена исследователями из Университета Колорадо и создана на основе стандартных технологий микрофлюидики
[
32
A Microfluidic Model of Hemostasis Sensitive to Platelet Function and Coagulation

R. Schoeman, K. Rana, N. Danes, M. Lehmann, J. Di Paola, A. Fogelson, K. Leiderman, K. Neeves

Cellular and Molecular Bioengineering. 2017, 10, 3-15

]
. Оригинальное устройство было разработано в форме буквы «H» (материальной основой является PDMS), где два внешних вертикальных канала представляют сосудистый и внесосудистый соответственно. Вертикальные каналы соединены горизонтальным каналом, имитирующим отверстие в стенке сосуда, которое называется каналом повреждения (Рис. 5). Фибриллярный коллаген I типа, рекомбинантный тканевый фактор человека или их комбинация адсорбировались на стенках данного канала. Таким образом, канал повреждения был покрыт компонентами, которые находятся в стенке сосудов и способствуют инициации гемостатического ответа в случае повреждения сосуда. Рекальцифицированная цельная кровь и буфер подавались через сосудистые и внесосудистые каналы соответственно. Перепады давления в цельной крови и буфере были отрегулированы таким образом, чтобы средняя пристеночная скорость сдвига стенки в кровяном канале составляла 2200 с-1. Постоянная разница давления в канале, имитирующем повреждение сосуда, отражала перепад давления между сосудом и окружающими его тканями. Подавление функции тромбоцитов или коагуляции привело к увеличению времени закрытия канала повреждения или нестабильности формирующихся тромбов. Время закрытия канала повреждения при наличии только коллагена составляло более 20 минут, при наличии только ТФ - 15,8±2 минуты, а при одновременном их нанесении - 7,5±1,6 минут. Разработанная система в виду своей технической простоты может быть использована в качестве интегрального теста гемостаза, позволяющего оценивать общее состояние данной системы и, возможно, выявлять высокие риски кровотечений или тромбозов.
Схема микрофлюидной модели гемостаза с каналом повреждения. Цитратная цельная кровь и рекальцифицированный буфер были совмещены в объемном соотношении 9:1. Рекальцифицированная цельная кровь (красная) и буфер для отмывки (синий) были впрыснуты в два разных вертикальных канала устройства внесосудистого повреждения. Канал горизонтального повреждения (состоящий из коллагена и/или ТФ) соединяет два вертикальных канала. Адаптировано из [32].
Figure 5. Схема микрофлюидной модели гемостаза с каналом повреждения. Цитратная цельная кровь и рекальцифицированный буфер были совмещены в объемном соотношении 9:1. Рекальцифицированная цельная кровь (красная) и буфер для отмывки (синий) были впрыснуты в два разных вертикальных канала устройства внесосудистого повреждения. Канал горизонтального повреждения (состоящий из коллагена и/или ТФ) соединяет два вертикальных канала. Адаптировано из [32].
Следующая из опубликованных моделей гемостаза была предложена командой Вилбура Лама. Помимо использования многослойной PDMS камеры исследователи включили в предложенную модель монослой эндотелиальных клеток. Повреждение данной системе моделируется за счет актуализации пневматического клапана, который резко изменяет геометрию системы и приводит к вытеканию крови в специальный канал (Рис. 6). Таким образом, разработанная комплексная модель кровотечения при механическом повреждении включает «эндотелиализированную» микрофлюидную систему в сочетании с микроскопическим пневматическим клапаном, который вызывает сосудистое «повреждение»
[
33
A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis

Y. Sakurai, E. Hardy, B. Ahn, R. Tran, M. Fay, J. Ciciliano, R. Mannino, D. Myers, Y. Qiu, M. Carden, W. Baldwin, S. Meeks, G. Gilbert, S. Jobe, W. Lam

Nature Communications. 2018, 9, None

]
. В процессе прокачки через систему цельной крови авторами визуализируется формирование гемостатической пробки и измеряется «время кровотечения in vitro». Таким образом, в качестве активаторов гемостатического ответа в данной модели выступают сами поврежденные эндотелиальные клетки, а также внеклеточные белки субэндотелиального матрикса, наработанные клетками в процессе культивации.
Многослойная микрофлюидная модель кровотечения. (a) Три PDMS слоя: 1 – сосудистый слой, состоящий из сосудистого канала и канала кровотечения, 2 – PDMS клапанный слой, 3 – слой, деформирующий клапан из-за уменьшения давления; (b) Схема объединенного устройства; (c) Общая схема системы: во-первых, эндотелиальные клетки (розовый) культивированы, формируя монослой в сосудистом канале (синий). (d) Затем, цельная кровь (красный) пропускается и клапанный слой перемещается из-за увеличения давления в камере привода клапана (белый). Кровь, пока клапан находится в открытой позиции, течет через сосудистый канал, а также через новый канал, симулируя кровотечение из-за проникающего повреждения. Адаптировано из [33].
Figure 6. Многослойная микрофлюидная модель кровотечения. (a) Три PDMS слоя: 1 – сосудистый слой, состоящий из сосудистого канала и канала кровотечения, 2 – PDMS клапанный слой, 3 – слой, деформирующий клапан из-за уменьшения давления; (b) Схема объединенного устройства; (c) Общая схема системы: во-первых, эндотелиальные клетки (розовый) культивированы, формируя монослой в сосудистом канале (синий). (d) Затем, цельная кровь (красный) пропускается и клапанный слой перемещается из-за увеличения давления в камере привода клапана (белый). Кровь, пока клапан находится в открытой позиции, течет через сосудистый канал, а также через новый канал, симулируя кровотечение из-за проникающего повреждения. Адаптировано из [33].
В недавней работе исследователей из университета Пенсильвании описывается новый подход к моделированию гемостаза in vitro, в котором стенка искусственного сосуда прокалывается иглой (Рис. 7), создавая тем самым канал, через который из-за перепада давления происходит утечка крови
[
34
A Human Vascular Injury‐on‐a‐Chip Model of Hemostasis

I. Poventud‐Fuentes, K. Kwon, J. Seo, M. Tomaiuolo, T. Stalker, L. Brass, D. Huh

Small. 2021, 17, 2004889

]
. С помощью анализа микроскопических изображений авторы представили количественные данные о динамике образования гемостатической пробки и закрытия места повреждения и продемонстрировали их качественное сходство с ситуациями in vivo. Модель включает PDMS-основу для формирования геля из коллагена, а также канала, имитирующего кровеносный сосуд (Рис. 7). Коллаген, смешанный с релипидированным ТФ полимеризуется в специальном сосуде, cтенки которого образованы PDMS, а эндотелиальные клетки высевают непосредственно поверх коллагенового геля и культивируют для образования монослоя. Повреждение сосуда (с диаметром 1 мм) получается с помощью иглы (30G), а размеры повреждения (отверстия в геле) варьируются от 120 мкм до 200 мкм и определяются диаметром иглы (Рис. 7). Для изучения образования гемостатической пробки через внутрисосудистый канал прокачивали цельную человеческую кровь, рекальцифицированную в присутствии КТИ (ингибитора трипсина из кукурузы) при скорости сдвига 100 с-1 (что соответствует крупным венам в организме человека). Одновременное накопление тромбоцитов и фибрина в месте повреждения приводило к образованию гемостатических пробок, которые останавливали кровопотерю в течение 10 минут после травмы. Основные результаты данной работы показывают, что данная модель сосудистого повреждения представляет собой потенциально мощный инструмент для имитации и исследования внутренней работы гемостатического ответа. Сложность данной модели (связанная в первую очередь с использованием монослоя эндотелиальных клеток) затрудняет ее применение для решения клинических задач (оценки рисков тромбозов или кровотечений), но позволяет в будущем применять ее для исследования фундаментальных задач физиологии гемостаза, а также для доклинических исследований новых лекарственных препаратов.
In vitro модель гемостаза в искусственном сосуде. a) Система инкапсулирована в оболочку из PDMS. Основные компоненты показаны на схеме и соответствующе обозначены. b) Последовательные шаги процесса протыкания совершаются иглой. Игла двигается справа налево и сначала протыкает канал с кровью (правая часть), затем проникает через эндотелиальный слой (красный) и секцию с коллагеновым гелем (посередине) и, наконец, достигает «внесосудистую» область, обозначенную как камера кровотечения. Адаптировано из [34].
Figure 7. In vitro модель гемостаза в искусственном сосуде. a) Система инкапсулирована в оболочку из PDMS. Основные компоненты показаны на схеме и соответствующе обозначены. b) Последовательные шаги процесса протыкания совершаются иглой. Игла двигается справа налево и сначала протыкает канал с кровью (правая часть), затем проникает через эндотелиальный слой (красный) и секцию с коллагеновым гелем (посередине) и, наконец, достигает «внесосудистую» область, обозначенную как камера кровотечения. Адаптировано из [34].

Заключение

В развитии in vitro моделей тромбоза и гемостаза на сегодняшний день можно выделить следующие тенденции: модели, ставящие своей целью ответы на фундаментальные вопросы устройства гемостатического ответа демонстрируют тенденцию к учету все большего количества факторов и особенностей микроокружения, имеющих место в живом организме: механические свойства тканей (переход к гидрогелям), наличие как поврежденных/активированных эндотелиальных клеток, так и здорового эндотелия, учет особенностей гемодинамики (наличие стеноза канала в случае моделирования артериального тромбоза, пульсаций потока, а также шунтирующих сосудов) и так далее. С другой стороны, системы, которые находят все более широкое применение для решения клинических задач, в силу необходимости стандартизации остаются относительно простыми в плане технического устройства и реализации. Важной тенденцией последних лет также стало развитие моделей гемостаза, которым в данном образе уделяется отдельная секция. Создание новых реалистичных моделей гемостаза представляется нам крайне важной задачей, так как в перспективе позволит ответить на важнейшие фундаментальные вопросы в данной области исследований.

Финансирование

Работа была поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований грант 19-51-15004, и грантом эндаунмент фонда "Наука - детям". Эта работа также была выполнена при поддержке Программы Развития Междисциплинарной Научной и Образовательной Школой Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова «Фотонные и Квантовые Технологии. Цифровая медицина».

Библиографические ссылки статьи:

  1. Arterial thrombosis—insidious, unpredictable and deadly

    S. Jackson

    Nature Medicine. 2011, 17, 1423-1436

  2. Murine Models of Vascular Thrombosis

    R. Westrick, M. Winn, D. Eitzman

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007, 27, 2079-2093

  3. High-throughput measurement of human platelet aggregation under flow: application in hemostasis and beyond

    S. Brouns, J. van Geffen, J. Heemskerk

    Platelets. 2018, 29, 662-669

  4. The use of microfluidics in hemostasis

    K. Neeves, A. Onasoga, A. Wufsus

    Current Opinion in Hematology. 2013, 20, 417-423

  5. Subcommittee on Biorheology. In vitro flow‐based assay: From simple toward more sophisticated models for mimicking hemostasis and thrombosis.

    5. Mangin PH, Neeves KB, Lam WA, Cosemans JM, Korin N, Kerrigan SW, Panteleev MA

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2021, 19, 582-7

  6. In Silico Hemostasis Modeling and Prediction

    D. Nechipurenko, A. Shibeko, A. Sveshnikova, M. Panteleev

    Hämostaseologie. 2020, 40, 524-535

  7. Microfluidic focal thrombosis model for measuring murine platelet deposition and stability: PAR4 signaling enhances shear-resistance of platelet aggregates

    K. NEEVES, S. MALONEY, K. FONG, A. SCHMAIER, M. KAHN, L. BRASS, S. DIAMOND

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2008, 6, 2193-2201

  8. Side view thrombosis microfluidic device with controllable wall shear rate and transthrombus pressure gradient

    R. Muthard, S. Diamond

    Lab on a Chip. 2013, 13, 1883

  9. Tissue‐engineered 3D microvessel and capillary network models for the study of vascular phenomena

    M. Bogorad, J. DeStefano, A. Wong, P. Searson

    Microcirculation. 2017, 24,

  10. Microengineered human blood–brain barrier platform for understanding nanoparticle transport mechanisms

    S. Ahn, Y. Sei, H. Park, J. Kim, Y. Ryu, J. Choi, H. Sung, T. MacDonald, A. Levey, Y. Kim

    Nature Communications. 2020, 11,

  11. Engineering of Hydrogel Materials with Perfusable Microchannels for Building Vascularized Tissues

    R. Xie, W. Zheng, L. Guan, Y. Ai, Q. Liang

    Small. 2020, 16, 1902838

  12. Bioprinted thrombosis-on-a-chip

    Y. Zhang, F. Davoudi, P. Walch, A. Manbachi, X. Luo, V. Dell'Erba, A. Miri, H. Albadawi, A. Arneri, X. Li, X. Wang, M. Dokmeci, A. Khademhosseini, R. Oklu

    Lab on a Chip. , 16, 4097-4105

  13. Pharmacological Blockade of Glycoprotein VI Promotes Thrombus Disaggregation in the Absence of Thrombin

    M. Ahmed, V. Kaneva, S. Loyau, D. Nechipurenko, N. Receveur, M. Le Bris, E. Janus-Bell, M. Didelot, A. Rauch, S. Susen, N. Chakfé, F. Lanza, E. Gardiner, R. Andrews, M. Panteleev, C. Gachet, M. Jandrot-Perrus, P. Mangin

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2127-2142

  14. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

    D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

  15. Core and shell platelets of a thrombus: A new microfluidic assay to study mechanics and biochemistry

    M. DeCortin, L. Brass, S. Diamond

    Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2020, 4, 1158-1166

  16. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

    N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Blood. 2016, 128, 1745-1755

  17. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow

    F. Swieringa, C. Baaten, R. Verdoold, T. Mastenbroek, N. Rijnveld, K. van der Laan, E. Breel, P. Collins, M. Lancé, Y. Henskens, J. Cosemans, J. Heemskerk, P. van der Meijden

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2016, 36, 692-699

  18. Contribution of platelet glycoprotein VI to the thrombogenic effect of collagens in fibrous atherosclerotic lesions

    J. Cosemans, M. Kuijpers, C. Lecut, S. Loubele, S. Heeneman, M. Jandrot-Perrus, J. Heemskerk

    Atherosclerosis. 2005, 181, 19-27

  19. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation

    S. de Witt, F. Swieringa, R. Cavill, M. Lamers, R. van Kruchten, T. Mastenbroek, C. Baaten, S. Coort, N. Pugh, A. Schulz, I. Scharrer, K. Jurk, B. Zieger, K. Clemetson, R. Farndale, J. Heemskerk, J. Cosemans

    Nature Communications. 2014, 5,

  20. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner

    E. Westein, A. van der Meer, M. Kuijpers, J. Frimat, A. van den Berg, J. Heemskerk

    Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013, 110, 1357-1362

  21. A shear gradient–dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation

    W. Nesbitt, E. Westein, F. Tovar-Lopez, E. Tolouei, A. Mitchell, J. Fu, J. Carberry, A. Fouras, S. Jackson

    Nature Medicine. 2009, 15, 665-673

  22. Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen in a von Willebrand factor-dependent manner.

    Receveur, Nicolas, Dmitry Nechipurenko, Yannick Knapp, Aleksandra Yakusheva, Eric Maurer, Cécile V. Denis, François Lanza, Mikhail Panteleev, Christian Gachet, and Pierre H. Mangin.

    Haematologica. 2020, 105,

  23. Thrombin Flux and Wall Shear Rate Regulate Fibrin Fiber Deposition State during Polymerization under Flow

    K. Neeves, D. Illing, S. Diamond

    Biophysical Journal. 2010, 98, 1344-1352

  24. Thrombin generation and fibrin formation under flow on biomimetic tissue factor-rich surfaces

    A. Onasoga-Jarvis, T. Puls, S. O'Brien, L. Kuang, H. Liang, K. Neeves

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2014, 12, 373-382

  25. Impact of Tissue Factor Localization on Blood Clot Structure and Resistance under Venous Shear

    V. Govindarajan, S. Zhu, R. Li, Y. Lu, S. Diamond, J. Reifman, A. Mitrophanov

    Biophysical Journal. 2018, 114, 978-991

  26. Dynamics of Blood Flow and Thrombus Formation in a Multi-Bypass Microfluidic Ladder Network

    J. Zilberman-Rudenko, J. Sylman, H. Lakshmanan, O. McCarty, J. Maddala

    Cellular and Molecular Bioengineering. 2017, 10, 16-29

  27. High Shear Thrombus Formation under Pulsatile and Steady Flow

    L. Casa, D. Ku

    Cardiovascular Engineering and Technology. 2014, 5, 154-163

  28. The influence of the pulsatility of the blood flow on the extent of platelet adhesion.

    Zhao XM, Wu YP, Cai HX, Wei R, Lisman T, Han JJ, Xia ZL, de Groot PG

    Thrombosis research. 2008, 121, 821-5

  29. A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function

    A. Hafezi-Moghadam, K. Thomas, C. Cornelssen

    American Journal of Physiology-Cell Physiology. 2004, 286, C876-C892

  30. Platelets Drive Thrombus Propagation in a Hematocrit and Glycoprotein VI–Dependent Manner in an In Vitro Venous Thrombosis Model

    M. Lehmann, R. Schoeman, P. Krohl, A. Wallbank, J. Samaniuk, M. Jandrot-Perrus, K. Neeves

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2018, 38, 1052-1062

  31. Point-of-Care Diagnostic Assays and Novel Preclinical Technologies for Hemostasis and Thrombosis

    C. Caruso, W. Lam

    Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 2021, 47, 120-128

  32. A Microfluidic Model of Hemostasis Sensitive to Platelet Function and Coagulation

    R. Schoeman, K. Rana, N. Danes, M. Lehmann, J. Di Paola, A. Fogelson, K. Leiderman, K. Neeves

    Cellular and Molecular Bioengineering. 2017, 10, 3-15

  33. A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis

    Y. Sakurai, E. Hardy, B. Ahn, R. Tran, M. Fay, J. Ciciliano, R. Mannino, D. Myers, Y. Qiu, M. Carden, W. Baldwin, S. Meeks, G. Gilbert, S. Jobe, W. Lam

    Nature Communications. 2018, 9,

  34. A Human Vascular Injury‐on‐a‐Chip Model of Hemostasis

    I. Poventud‐Fuentes, K. Kwon, J. Seo, M. Tomaiuolo, T. Stalker, L. Brass, D. Huh

    Small. 2021, 17, 2004889