Русский 
English Анализ уровня окислительного стресса по оценке повреждения белка плазмы сывороточного альбумина под действием окислительного агента
Введение
Окислительный стресс – состояние избыточного образования в клетках и тканях активных форм кислорода (АФК), которые не могу быть нейтрализованы антиоксидантами, – сейчас рассматривается в качестве важного патогенетического звена многих заболеваний вследствие универсальности окислительно-восстановительных реакций в организме человека [1-12].
Окислительный стресс может возникать как под действием неблагоприятных экзогенных факторов, так и в результате активации эндогенных механизмов генерации АФК и ослабления антиоксидантной защиты организма.
К основным активным формам кислорода (АФК) относятся супероксидный радикал (O2●-), гидроксильный радикал (HO●), перекись водорода (H2O2), окись азота (NO●) и пероксинитрит (ONOO–).
Супероксидный радикал (O2●-) образуется, в основном, в митохондриях [12], при этом его основное назначение – образование других форм АФК.
Перекись водорода H2O2 может образовываться из супероксидного радикала под действием супероксиддисмутазы (O2●- + O2●- + 2H+ → H2O2 + O2). Нейтральная молекула H2O2 наименее реакционноспособна среди АФК и в отсутствии ионов металлов стабильна, но высокая диффузионная способность позволяет ей легко преодолевать плазматическую мембрану и участвовать в большом количестве реакций образования АФК.
Гидроксильный радикал (HO●) является наиболее реакционным и «вредным» из АФК, с его образованием часто связывается цитотоксическое и мутагенное действие АФК при окислительном стрессе.
Основным источником гидроксильных радикалов (HO●) в биологических системах служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности (Fe2+, Cu+, Co2+, Mn2+, Cr4+), особенно Fe2+, и перекиси водорода:
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + HO● + OH-.
Также опасный гидроксильный радикал может возникнуть при наличии в среде опять же перекиси водорода H2O2 и супероксидного радикала O2●- в реакции Хабера-Вейсса:
O2●- + H2O2 → O2 + HO● + OH-.
Дисбаланс равновесия между появлением АФК и их нейтрализацией антиоксидантными системами индуцирует в организме возникновение окислительного стресса, играющего важную роль в развитии многих заболеваний [1-12]. В частности, именно с позиций свободнорадикальной теории окислительного стресса объяснены в настоящее время многие ключевые моменты развития атеросклероза: разнообразие окислительных модификаций липопротеинов и белков плазмы крови приводит к повреждению стенок сосудов, аккумуляции холестерина и возникновению основного осложнения атеросклероза – тромбоза сосудов.
Бычий сывороточный альбумин (БСА, 64 кДа, pI БСА 4.9) – это белок из семейства альбуминов [13], выполняющий транспортные функции в плазме крови. Высокое содержание БСА в крови и в различных тканях, говорящее о ключевом значении этого белка для организма, объясняет интерес к изучению окислительного повреждения глобул БСА, что важно для понимания патогенеза различных заболеваний.
В данной работе представлены исследования методами флуоресцентного анализа окислительного повреждения глобул БСА перекисью водорода, являющейся возможным источником опасного гидроксильного радикала в ходе реакций Фентона и Хабера-Вейсса: выполнен анализ тушения собственной триптофановой флуоресценции БСА при добавлении перекиси водорода в растворы и методами математического моделирования определены константы тушения флуоресценции БСА под действием H2O2.
Собственная флуоресценция белков широко изучается при оценках конформационного состояния белков [14-19]. Флуоресцентные методы высоко чувствительны к тонким конформационным перестройкам БСА, что позволяет использовать их для прямого анализа качественного состояния белка и косвенного анализа состояния организма при различных патологических процессах, в частности, в состоянии окислительного стресса.
Материалы и Методы
На основе буферных растворов с заданными значениями pH (0.1 М CH3COOH – KOH, pH 3.0–5.0 и 0.1 М KH2PO4 – 0.1 М NaOH, pH 6.0–7.0, реактивы квалификации “х.ч.”) были приготовлены растворы 5 мкМ БСА (БСА производства фирмы Sigma-Aldrich), в которые были добавлены различные концентрации перекиси водорода H2O2 (5–200 мкМ) при pH 3.0–7.0.
Флуоресцентные исследования образцов растворов «БСА – H2O2» проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer LS55 при комнатной температуре. Измерения флуоресценции образцов БСА проводились через фиксированный интервал времени после добавления в них различных концентраций H2O2.
Триптофановая флуоресценция БСА регистрировалась в диапазоне 300–500 нм при возбуждении светом с длиной волны lвозб = 295 нм. Спектры флуоресценции БСА обрабатывались программой FL Winlab (Perkin Elmer).
Следует отметить, что найденные из экспериментов значения констант тушения флуоресценции БСА в растворах с добавлением H2O2 не должны рассматриваться в смысле их абсолютных значений, они важны для сравнения их значений и для оценки окислительного повреждения БСА при различных pH.
Результаты и Обсуждение
Анализ экспериментальных спектров триптофановой флуоресценции БСА в растворах при добавлении окислительного агента
Исследованы спектры собственной триптофановой флуоресценции БСА при добавлении в белковые растворы перекиси водорода H2O2 (5–200 мкМ) при pH 3.0–7.0 (рис. 1 – пример спектров флуоресценции БСА при pH 5.0 при добавлении различных концентраций перекиси водорода в растворы).
Видно (рис. 1), что при добавлении перекиси водорода в белковые растворы происходит синее смещение максимума спектра флуоресценции белка: в растворах без H2O2 максимум флуоресценции на 347 нм, в растворах с H2O2 максимум спектра флуоресценции на 342 нм. Коротковолновый сдвиг, скорее всего, говорит о погружении поверхностных триптофановых остатков БСА внутрь глобулы, т.е. о конформационном изменении глобул БСА под действием окислительного агента.
fig_1[]
Построены зависимости интенсивности в максимуме спектра триптофановой флуоресценции БСА от концентрации H2O2 в растворах с различными значениями pH (рис. 2).
Обнаружено (рис. 2), что при всех значениях pH (3.0–7.0) происходит тушение триптофановой флуоресценции БСА при добавлении H2O2. Добавление 5–20 мкМ H2O2, т.е. концентрации равной концентрации БСА или немного большей её, приводит к незначительному тушению флуоресценции БСА и к незначительному изменению конформации белка. Добавление больших концентраций (20–200 мкМ) H2O2 в белковые растворы приводит к значительному тушению триптофановой флуоресценции БСА и, следовательно, к существенному окислительному повреждению структуры БСА.
Снижение интенсивности собственной флуоресценции БСА при добавлении перекиси водорода в раствор указывает на два одновременных процесса: 1) слабое воздействие низких концентраций H2O2 на триптофановые остатки БСА, а также изменение их микроокружения (повреждение остатков ароматических аминокислот белка отражается на флуоресцентных свойствах белка), 2) изменение нативного конформационного состояния глобул белка под действием высоких концентраций окислительного агента.
Figure 2. Интенсивность в максимуме спектра флуоресценции БСА в зависимости от концентрации H2O2 в растворах при различных значениях pH.
При сравнении величины тушения флуоресценции БСА при добавлении H2O2 в растворы при различных значениях pH видно (рис. 2), что более сильное тушение флуоресценции имеет место при более низких значениях pH.
Рассчитано среднее изменение интенсивности в максимуме спектра флуоресценции БСА при изменении концентрации H2O2 в зависимости от значений pH (рис. 3).
Значительное тушение флуоресценции БСА под действием H2O2 происходит при низких значениях pH (примерно 3.0–5.0), меньших изоэлектрической точки БСА (pI 4.9). Это объясняется тем, что H2O2 как окислитель действует сильнее в кислой среде. Следовательно, более сильное перекисное повреждение БСА и изменение его конформации происходит при более низких значениях pH. В водных растворах перекись водорода ведет себя как очень слабая кислота, проявляя слабые кислотные свойства.
Как упоминалось выше, перекись водорода является в ходе двух реакций поставщиком мощного высоко реакционноспособного окислителя – гидроксильного радикала (HO●), который разрушающе действует на структуру белка.
Figure 3. Среднее изменение интенсивности в максимуме спектра флуоресценции БСА при изменении концентрации H2O2 в растворах в зависимости от значения pH.
Хотя перекись водорода в целом сама обладает малой реакционной способностью к окислению органических молекул в водной среде, но ее феномен в окислительном стресс заключается, во-первых, in vivo в ее легкой способности диффундировать через клеточные мембраны, и, во-вторых, как in vivo, так и in vitro в генерации из перекиси водорода агрессивных свободнорадикальных соединений.
Образовавшиеся в наших исследованиях в ходе реакций in vitro с перекисью водорода свободные радикалы (в частности, гидроксильный радикал HO●), во-первых, влияют на триптофановые остатки БСА, меняя их микроокружение, и, во-вторых, повреждают нативную конформацию белка, вызывая динамическую перестройку глобул БСА.
При состоянии окислительного стресса под действием перекиси водорода и свободнорадикальных продуктов ее диссоциации разрушаются дисульфидные и другие типы связей, участвующих в формировании нативной конформации глобул белка, происходит изменение микроокружения триптофановых хромофорных групп БСА на фоне динамической перестройки глобул и, как следствие, происходит тушение триптофановой флуоресценции БСА.
Для анализа окислительных повреждений БСА перекисью водорода при различных значениях pH построены (рис. 4) зависимости (F0/F) – 1 от [Q0], где F0 – интенсивность флуоресценции БСА в отсутствие H2O2, F – интенсивность флуоресценции БСА в присутствии H2O2, [Q0] – концентрация H2O2.
![Зависимости (F0/F) – 1 от [Q0], где F0 – интенсивность флуоресценции БСА в отсутствие H2O2, F – интенсивность флуоресценции БСА в присутствии H2O2, [Q0] – концентрация H2O2. Значения pH: 3.0 (1), 4.0 (2), 5.0 (3), 6.0 (4), 7.0 (5).](https://astore.sbpreports.com/issues/articles/22/figures/4fig.jpg?v=qzjxp)
Figure 4. Зависимости (F0/F) – 1 от [Q0], где F0 – интенсивность флуоресценции БСА в отсутствие H2O2, F – интенсивность флуоресценции БСА в присутствии H2O2, [Q0] – концентрация H2O2. Значения pH: 3.0 (1), 4.0 (2), 5.0 (3), 6.0 (4), 7.0 (5).
Математическая модель аппроксимации кривых тушения флуоресценции БСА по теории Штерна – Фольмера («эффективные» константы)
Проведен анализ тушения флуоресценции БСА добавлением перекиси водорода согласно модели Штерна – Фольмера с линейной аппроксимацией.
Следует отметить, что в данном нелинейном случае при аппроксимации графиков по модели Штерна – Фольмера можно говорить только об усредненных, эффективных константах тушения. Линейное приближение фактически есть линия тренда рассматриваемого процесса.
При тушении флуоресценции БСА в растворах добавлением перекиси водорода можно согласно теории Штерна – Фольмера [14, 15] записать:
F0/F = 1 + Kэфф•[Q0],
где Kэфф – эффективная константа тушения флуоресценции БСА, определяющая фактически окислительное повреждение белка перекисью водорода (М-1). Данная модель Штерна-Фольмера описывает линейную зависимость (F0/F) – 1 от [Q0].
Получена эффективная константа Kэфф тушения флуоресценции БСА при добавлении H2O2 в растворы при различных значениях pH (рис. 5).
Figure 5. Константы Kэфф тушения собственной флуоресценции БСА добавлением перекиси водорода H2O2 в растворы с различными значениями pH.
Видно (рис. 5), что наибольшие значения эффективная константа тушения флуоресценции БСА имеет при низких значениях pH, меньших изоэлектрической точки БСА, следовательно, при этих значениях pH происходят существенные окислительные повреждения БСА под действием свободнорадикальных продуктов, приводящие к крупным динамическим изменениям глобул белка. Тогда как при высоких значениях pH (>5.0), больших изоэлектрической точки БСА, константы тушения флуоресценции БСА имеют меньшие значения (в 2.2 – 4.5 раза), что указывает на меньшее окислительное повреждение БСА добавлением перекиси водорода при этих значениях pH.
Математическая модель разложения кривых тушения флуоресценции БСА на два линейных случая в рамках теории Штерна – Фольмера
Для более точного описания полученных нелинейных зависимостей (F0/F) – 1 от [Q0] разложим их на две составляющие – для низких концентраций окислительного агента (H2O2 < 20 мкМ) и для высоких концентраций окислительного агента (H2O2 > 20 мкМ), линейно аппроксимируем каждую составляющую отдельно и получим две константы (рис. 6, константа K1 для H2O2 < 20 мкМ и константа K2 для H2O2 > 20 мкМ) тушения флуоресценции БСА в присутствии окислительного агента перекиси водорода.
Константа K1 тушения флуоресценции БСА в присутствии H2O2 отражает воздействие низких концентраций H2O2 на сами триптофановые остатки БСА, а также на их микроокружение: окислительное повреждение ароматических колец триптофановых остатков БСА проявляется в их флуоресцентных свойствах. Образование радикальных соединений происходит при взаимодействии перекиси водорода H2O2 и её продукта гидроксильного радикала HO• с кольцами триптофановых аминокислотных остатков БСА.
Figure 6. Константы K тушения собственной флуоресценции БСА при добавлении перекиси водорода H2O2 в растворы с различными значениями pH. K1 – константа тушения флуоресценции БСА при концентрации H2O2 меньше 20 мкМ, K2 – константа тушения флуоресценции БСА при концентрации H2O2 больше 20 мкМ.
Также, скорее всего, помимо триптофановых остатков, повреждаются тирозиновые остатки БСА, также дающие некоторый небольшой вклад в собственную флуоресценцию белка (при возбуждении 295 нм), а из тирозиновых остатков возможно образование фенокси-радикалов (Tyr-O•), димеризующихся с образованием бифенолов (битирозинов), вызывающих образование белковых сшивок и являющихся одним из маркеров окислительного повреждения белков.
Константа K2 тушения флуоресценции БСА в присутствии H2O2 показывает «дальнодействующее» влияние высоких концентраций перекиси водорода уже не на ближнее окружение двух триптофановых остатков БСА, а на глобулу белка в целом: происходит изменение нативного конформационного состояния глобул БСА под действием высоких концентраций H2O2.
Как следует из рис. 6, обе константы (K1 и K2) тушения флуоресценции БСА в присутствии H2O2 чувствительны к вариации значений pH растворов, что объясняется тем, что H2O2 как окислитель действует сильнее в кислой среде, и, как следствие, более сильное перекисное повреждение БСА происходит при более низких значениях pH.
Сравнивая две константы, можно заключить, что константа K1, определяемая окислительным повреждением микроокружения триптофановых остатков, более чувствительна к изменению pH по сравнению с константой K2, определяемой свободнорадикальным повреждением глобул БСА в целом.
Также видно (рис. 6), что значения константы K1 больше в 3.5 – 6.8 раз значений константы K2. Как известно, процесс окислительной модификации белков носит сложный характер в связи с образованием большого количества окисленных продуктов. Окислительное повреждение белков может быть связано как с нарушением самой полипептидной цепи, так и с повреждением отдельных аминокислотных остатков. И наиболее чувствительными к окислению являются ароматические аминокислотные остатки белков, такие как триптофановые, что и подтверждают высокие значения константы K1 по сравнению с константой K2.
Заключение
Окислительный стресс приводит к окислительной модификации различных макромолекул, не только к перекисному окислению липидных молекул, но и к повреждению таких как макромолекул, как белки. Белки являются одними из основных мишеней для АФК, образующихся в процессе фотохимических воздействий, металл-зависимого окисления или как продукт окислительно-восстановительных реакций.
Изучение окислительной модификации белков появилось, как научное направление, сравнительно недавно по сравнению с классическими работами по перекисному окислительному повреждению липидов, но уже сейчас имеет широкое прикладное применение в медицинской практике [20-22].
Окислительное повреждение БСА в модели окислительного стресса, вызванного окислительным агентом перекисью водорода, было изучено в данной работе спектрофлуометрическим методом: показано зависимое от концентрации перекиси водорода тушение собственной флуоресценции БСА, объясняемое как окислительным повреждением микроокружения триптофановых остатков БСА, так и изменением нативной конформации белковых глобул при окислительном повреждении.
Нативная конформация глобул БСА повреждается под действием окислительного агента в связи с образованием радикальных соединений в составе самого белка: углеродных радикалов, расположенных в глубине глобулы, пероксирадикалов, тиильных радикалов, азотистых радикалов и радикалов ароматических аминокислотных остатков.
Зарегистрированное тушение собственной флуоресценции БСА при повреждении окислительным агентом может быть использовано как метод оценки уровня окислительного стресса в организме, что крайне важно как для фундаментальной, так и для прикладной медицины для контроля окислительного стресса и подбора соответствующей терапии заболевания, поскольку свободнорадикальные окислительные повреждения играют важную роль во многих болезнях.
Вклад авторов
Вклад И.М.В. в работу был определяющим (планирование исследования, выполнение эксперимента, анализ данных, написание и редактирование текста статьи); А.А.В. анализировал данные и редактировал текст статьи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что они не имеют конфликта интересов.
Библиографические ссылки статьи:
Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) and ROS-Induced ROS Release
D. Zorov, M. Juhaszova, S. Sollott
Physiological Reviews. 2014, 94, 909-950
Reactive Oxygen Species (ROS)-Responsive Prodrugs, Probes, and Theranostic Prodrugs: Applications in the ROS-Related Diseases
P. Wang, Q. Gong, J. Hu, X. Li, X. Zhang
Journal of Medicinal Chemistry. 2021, 64, 298-325
Superoxide dismutases: Dual roles in controlling ROS damage and regulating ROS signaling
Y. Wang, R. Branicky, A. Noë, S. Hekimi
Journal of Cell Biology. 2018, 217, 1915-1928
Reactive oxygen species are physiological mediators of the noradrenergic signaling pathway in the mouse supraoptic nucleus
R. St-Louis, C. Parmentier, V. Grange-Messent, S. Mhaouty-Kodja, H. Hardin-Pouzet
Free Radical Biology and Medicine. 2014, 71, 231-239
UVB Radiation Induces Apoptosis in Keratinocytes by Activating a Pathway Linked to “BLT2-Reactive Oxygen Species”
H. Ryu, C. Kim, J. Kim, J. Chung, J. Kim
Journal of Investigative Dermatology. 2010, 130, 1095-1106
Reactive oxygen species mediate A??(25-35)-induced activation of BV-2 microglia
J. Kang, E. Park, I. Jou, J. Kim, E. Joe
Neuroreport. 2001, 12, 1449-1452
Mitochondria and reactive oxygen species in renal cancer
E. HERVOUET, H. SIMONNET, C. GODINOT
Biochimie. 2007, 89, 1080-1088
Increased Stress-Induced Generation of Reactive Oxygen Species and Apoptosis in Human Keratoconus Fibroblasts
M. Chwa, S. Atilano, V. Reddy, N. Jordan, D. Kim, M. Kenney
Investigative Opthalmology & Visual Science. 2006, 47, 1902
Elevated Cytosolic Na <sup>+</sup> Increases Mitochondrial Formation of Reactive Oxygen Species in Failing Cardiac Myocytes
M. Kohlhaas, T. Liu, A. Knopp, T. Zeller, M. Ong, M. Böhm, B. O'Rourke, C. Maack
Circulation. 2010, 121, 1606-1613
Reactive Oxygen Species, Cancer and Anti-Cancer Therapies
G. Manda, M. Nechifor, T. Neagu
Current Chemical Biology. 2009, 3, 342-366
Role of reactive oxygen and nitrogen species in the vascular responses to inflammation
P. R. Kvietys and D. N. Granger
Free Radical Biology and Medicine. 2012, 52(3), 556-592
Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты
Н. К. Зенков, В. З. Ланкин, Е. Б. Меньщикова
М: МАИК Наука / Интерпериодика. 2001, ,
Альбумин сыворотки крови в клинической медицине
Ю. А. Грызунов, Г. Е. Добрецов
М.: ИРИУС. 1994, ,
Физическая химия. Принципы и применение в биологических науках
И. Тиноко, К. Зауэр, Дж. Вэнг, Дж. Паглиси
М.: Техносфера. 2005, ,
Оптическая спектроскопия для химиков и биологов
В. Шмидт
М.: Техносфера. 2007, ,
Interaction of ionic detergent cethyltrimethylammonium bromide with human serum albumin at various values of pH: Spectroscopic study
I. Vlasova, A. Vlasov, A. Saletsky
Journal of Molecular Structure. 2010, 984, 332-338
Interaction of cationic surfactant cethyltrimethylammonium bromide with bovine serum albumin in dependence on pH: A study of tryptophan fluorescence
I. Vlasova, V. Zhuravleva, A. Vlasov, A. Saletsky
Journal of Molecular Structure. 2013, 1034, 89-94
Denaturation of bovine serum albumin initiated by sodium dodecyl sulfate as monitored via the intrinsic fluorescence of the protein
I. Vlasova, V. Zhuravleva, A. Saletsky
Russian Journal of Physical Chemistry B. 2014, 8, 385-390
Association Constants in the Bovine Serum Albumin/Human Serum Albumin–Tween 20 System in Aqueous Solutions
I. Vlasova, A. Vlasov, G. Grapendaal, A. Saletskii
Russian Journal of Physical Chemistry A. 2018, 92, 714-718
Protein oxidation in aging and the removal of oxidized proteins
A. Höhn, J. König, T. Grune
Journal of Proteomics. 2013, 92, 132-159
Protein S-nitrosylation and oxidation contribute to protein misfolding in neurodegeneration
T. Nakamura, C. Oh, X. Zhang, S. Lipton
Free Radical Biology and Medicine. 2021, 172, 562-577
Ozone-induced damage of fibrinogen molecules: identification of oxidation sites by high-resolution mass spectrometry
L. Yurina, A. Vasilyeva, M. Indeykina, A. Bugrova, M. Biryukova, A. Kononikhin, E. Nikolaev, M. Rosenfeld
Free Radical Research. 2019, 53, 430-455