Русский
Русский
English
Open access Клеточные системы

О факторах влияния на исследования сигнализации тромбоцитов с помощью кальциевых флуорофоров

София Галкина1
София Галкина
София Галкина
1
Физический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Информация на Google Scholar
,
Федор Балабин2,3
Федор Балабин
Федор Балабин
Адрес для переписки:[email protected]
2
Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН
3
Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева
Информация на Google Scholar
1.
Физический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
2.
Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН
3.
Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева

Введение

Кровь – важная составляющая организма человека, при этом система, поддерживающая целостность кровеносной системы – система гемостаза, грубо разделяется на плазменное и тромбоцитарно-сосудистое звенья
[
1
Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion

M. Panteleev, N. Dashkevich, F. Ataullakhanov

Thrombosis Research. 2015, 136, 699-711

https://doi.org/10.1016/j.thromres.2015.07.025

Article | Google Scholar

]
. Тромбоциты, мелкие безъядерные клетки, отвечают за остановку кровотечения, когда происходит нарушение сосудистой стенки. Тромбоциты образуют агрегат, поверхность которого обеспечивает ускорение работы плазменного звена гемостаза
[
2
Platelets and hemostasis

Panteleev M.A., Sveshnikova A.N.

Oncohematology. 2014, 9(2), 65-73

https://doi.org/10.17650/1818-8346-2014-9-2-65-73

Article | Google Scholar

]
. Для выполнения этой задачи тромбоциты входят в, так называемое, активированное состояние. Активированные тромбоциты адгезируют к поверхности и агрегируют друг с другом
[
3
Platelet Integrin αIIbβ3: Mechanisms of Activation and Clustering; Involvement into the Formation of the Thrombus Heterogeneous Structure

V. Kaneva, A. Martyanov, D. Morozova, M. Panteleev, A. Sveshnikova

Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2019, 13, 97-110

https://doi.org/10.1134/S1990747819010033

Article | Google Scholar

]
, меняют свою форму, секретируют содержимое гранул
[
4
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202101014

Article | Google Scholar

]
и иногда становятся прокоагулянтными
[
5,
Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation

N. Topalov, Y. Kotova, S. Vasil’ev, M. Panteleev

British Journal of Haematology. 2012, 157, 105-115

https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2011.09021.x

Article | Google Scholar

6
Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Blood. 2016, 128, 1745-1755

https://doi.org/10.1182/blood-2016-02-696898

Article | Google Scholar

]
. Таким образом, формируется кровяной сгусток
[
7
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.311390

Article | Google Scholar

]
.
Особенностью активации тромбоцитов является быстрая реакция на повреждение с характерным временем порядка одной секунды
[
8
PKC inhibition markedly enhances Ca2+ signaling and phosphatidylserine exposure downstream of protease-activated receptor-1 but not protease-activated receptor-4 in human platelets

M. HARPER, A. POOLE

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 1599-1607

https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2011.04393.x

Article | Google Scholar

]
. Возможно, такую скорость реакции система внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах обеспечивают ионы кальция. В покоящихся клетках концентрация свободных ионов кальция поддерживается на более низком уровне (10-20 нМ)
[
9
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

https://doi.org/10.3390/ijms21093035

Article | Google Scholar

]
, чем в плазме (1-2 мМ) и в эндоплазматическом ретикулуме, который является главным депо кальция в тромбоците, где концентрация кальция составляет 100-800 мкМ
[
10
Monitoring the intracellular store Ca2+ concentration in agonist-stimulated, intact human platelets by using Fluo-5N

S. SAGE, N. PUGH, M. MASON, A. HARPER

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 540-551

https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2010.04159.x

Article | Google Scholar

]
. Активация тромбоцитов, как и других клеток, контролируется концентрацией ионов кальция в цитозоле благодаря тому, что ионы кальция являются кофакторами многих ферментов, участвующих в активации тромбоцита
[
11,
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 2: receptors.

A. Martyanov, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 13-30

https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202103013

Article | Google Scholar

12,
Why Calcium? How Calcium Became the Best Communicator

E. Carafoli, J. Krebs

Journal of Biological Chemistry. 2016, 291, 20849-20857

https://doi.org/10.1074/jbc.R116.735894

Article | Google Scholar

13
The calcium-signalling saga: tap water and protein crystals

E. Carafoli

Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003, 4, 326-332

https://doi.org/10.1038/nrm1073

Article | Google Scholar

]
.
Как важный компонент активации тромбоцитов, кальциевая сигнализация изучается многие годы как в суспензии клеток
[
14,
Transient Receptor Potential Channels Function as a Coincidence Signal Detector Mediating Phosphatidylserine Exposure

M. Harper, J. Londoño, K. Quick, J. Londoño, V. Flockerzi, S. Philipp, L. Birnbaumer, M. Freichel, A. Poole

Science Signaling. 2013, 6, None

https://doi.org/10.1126/scisignal.2003701

Article | Google Scholar

15
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

https://doi.org/10.1111/jth.13442

Article | Google Scholar

]
, так и в одиночных тромбоцитах
[
16,
Roles of phospholipase C and Ca(2+)-ATPase in calcium responses of single, fibrinogen-bound platelets.

J. Heemskerk, P. Vis, M. Feijge, J. Hoyland, W. Mason, S. Sage

Journal of Biological Chemistry. 1993, 268, 356-363

https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)54158-2

Article | Google Scholar

17,
Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets

J. Heemskerk, J. Hoyland, W. Mason, S. Sage

Biochemical Journal. 1992, 283, 379-383

https://doi.org/10.1042/bj2830379

Article | Google Scholar

18
Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation

S. Obydennyy, A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 1867-1881

https://doi.org/10.1111/jth.13395

Article | Google Scholar

]
. Исследование кальциевой сигнализации производится с использованием внутриклеточных флуоресцентных красок – маленьких органических молекул-флуорофоров, параметры возбуждения и/или флуоресценции которых значительно изменяются при связывании с ионами кальция
[
19
Photophysics of Fluorescent Probes for Single-Molecule Biophysics and Super-Resolution Imaging

T. Ha, P. Tinnefeld

Annual Review of Physical Chemistry. 2012, 63, 595-617

https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-032210-103340

Article | Google Scholar

]
. Тем не менее, без повреждения клеточной мембраны, флуоресцентные краски могут проникать внутрь клетки только диффузией, поэтому эти молекулы модифицируются добавлением ацетометильного остатка, который гидролизуется в клетке под влиянием неспецифических эстераз
[
20
Measurement of Intracellular Calcium

A. Takahashi, P. Camacho, J. Lechleiter, B. Herman

Physiological Reviews. 1999, 79, 1089-1125

https://doi.org/10.1152/physrev.1999.79.4.1089

Article | Google Scholar

]
.
В этой работе, используя одиночные человеческие тромбоциты, мы изучили факторы, которые вероятно могут влиять на используемые флуоресцентные краски, и условия их входа в клетку при наблюдаемом кальциевом сигнале. Результатом работы стало, что интенсивность мобилизации кальция в тромбоците в ответ на активацию коррелирует с уровнем флуоресценции флуорофора в тромбоците.

Материалы и методы

 Следующие материалы были использованы: человеческий тромбин (Hematologic Technologies, Essex Junction, Vermont, USA), Calbryte 590 AM, Fura Red AM, Fluo-4 AM, and DiOC6 (3) (Molecular probes, Eugene, State Oregon, USA), CellTracker Violet BMQC Dye (Invitrogen), пробирки с гирудином 1,6 мл S-Monovette (SARSTEDT AG Co. KG, Germany), пробирки с цитратом натрия (3,8%) на 4,5 мл (IMPROVACUTER, China). Апираза из картофеля, АДФ и растворы реагентов были от Sigma-Aldrich. Антитела к VM64 были подарком проф. А.В. Мазурова (Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Национальный Медицинский Исследовательский Центр Кардиологии, Москва, Россия). Материалы для изготовления проточных камер были от ГемаКор (Москва, Россия) и МедСил (Мытищи, Россия).
Цельная кровь здоровых доноров (11 человек, 18-45 лет) в течение 3 часов после забора использовалась для всех экспериментов. Кровь собиралась в пробирки на 9 мл, содержащие 3,8% цитрат натрия (1:9 по объему) или в пробирки на 1,6 мл, содержащие гирудин). Исследования проводились в соответствие с Хельсинской Декларацией и одобрены независимым этическим комитетом ЦТП ФХФ РАН (решение №1 от 12.01.2018), подписанное информированное согласие было получено от каждого донора.
9 различных протоколов (А-Л) загрузки кальций-чувствительных красок были использованы в данном исследовании. Протоколы А-Д основаны на использовании крови, антикоагулированной с помощью цитрата натрия, в то время как в протоколах Е-З в качестве антикоагулянта был использован гирудин. 2 мкМ Calbryte590-AM было использовано в протоколах А, Б, Г, Д и З, в протоколе В использовалась DIOC6, в протоколе Е – Fluo-4-AM (2 мкМ), в протоколе Ж – Fura Red-AM (2 мкМ) и в протоколе З – CellTracker Violet BMQC Dye (2 мкМ и 4 мкМ). Апираза (0,3 МЕ/мл) использовалась для предотвращения пре-активации тромбоцитов из-за АДФ, секретируемого эритроцитами. Протокол Г также содержал Pluronic F-127 (0,04%) и в протоколе Д через 15 минут после инкубации с краской в пробу добавлялось 5 мМ MβCD (метил- β-циклодекстрин). Полученная смесь инкубировалась 30 минут (А, Б, Г, Д, Е, Ж, З) или 5 минут (В) на 37оС (А, Г, Д, Е, Ж, З) или на 25оС (Б, В). Таким образом, протокол А может быть использован как контроль для краски Calbryte590, протокол В – для DIOC6, Е – для Fluo-4, Ж – для Fura Red, З – для CellTracker Violet BMQC. Протоколы А, Б, Г и Д используют разные условия загрузки Calbryte590 в тромбоциты: Б характеризуется снижением температуры инкубации, Г – наличием Pluronic (вещество, облегчающее вход гидрофобного АМ в клетку) и Д – наличием MβCD (вещество, деплетирующее холестерол мембраны).
Плоскопараллельные проточные камеры, используемые в работе, были описаны раннее
[
21
Clusterization of Inositol Trisphosphate Receptors Determines the Shape of the Calcium Oscillation Peak in Platelet Cytosol

F. Balabin, D. Morozova, A. Mayorov, A. Martyanov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

Moscow University Physics Bulletin. 2018, 73, 526-533

https://doi.org/10.3103/S0027134918050041

Article | Google Scholar

]
. Для иммобилизации тромбоцитов были использованы покровные стекла, покрытые моноклональными антителами к CD31. Антитела против CD31 были изолированы, как описано в
[
22
A Monoclonal Antibody, VM64, Reacts with a 130 kDa Glycoprotein Common to Platelets and Endothelial Cells: Heterogeneity in Antibody Binding to Human Aortic Endothelial Cells

A. Mazurov, D. Vinogradov, N. Kabaeva, G. Antonova, Y. Romanov, T. VIasik, A. Antonov, V. Smirnov

Thrombosis and Haemostasis. 1991, 66, 494-499

https://doi.org/10.1055/s-0038-1646445

Article | Google Scholar

]
. Тромбоциты были выделены из цельной крови благодаря перфузии через проточную камеру и взаимодействию с покрытым антителами стеклом. Неприкрепившиеся клетки были вымыты с использованием буфера Тирода с кальцием, активация тромбоцитов затем наблюдалась во время перфузии буферов, содержащих активаторы тромбоцитов. Был использован микроскоп Nikon Eclipse Ti-E с объективом CFI Apochromat TIRF 100XC Oil на увеличении 100х и численной апертурой 1,49. Флуоресцентные краски возбуждались лазерами с длинами волн 405, 488 и 561 нм. Изображения были записаны с помощью камеры Andor iXon3 EMCCD. Схема эксперимента приведена на Рисунке 1.
None
Figure 1. None
Для анализа экспериментальных данных использовался ImageJ-Fiji. Регионы интереса (ROI) диаметром 2 мкм были выделены внутри клетки. В этих ROI флуоресценция измерялась каждый временной шаг. Основываясь на этих данных, были построены профили флуоресценции (Рис. 2). Пре-активация тромбоцитов оценивалась с помощью идентификации специфичных типов активации тромбоцитов в поле зрения, как описано раннее
[
23
Quantitative Assessment of Heterogeneity of Single Platelet Calcium Responses to Activation

Balabin FA.

Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2021, 5, PB1027

Google Scholar

]
: (1) слабая активация (меньше 5 случайных одиночных пиков в минуту), (2) активация (множество стохастических пиков, которые обычно не формируют кластеры), (3) сильная активация (кластеры пиков в профиле) и (4) стабильно высокий ответ (изменения флуоресценции, в основном, связаны с выгоранием или вытеканием флуоресцентной краски) (Рис.2).
None
Figure 2. None
Количество флуорофора, «загруженного» в клетку считалось как средняя флуоресценция 10% точек с самой низкой интенсивностью флуоресценции (Рис.3).
None
Figure 3. None

Результаты и обсуждение

Тромбоциты гетерогенно загружаются разными флуоресцентными красками

Разные краски гетерогенно загружаются в тромбоциты. Количество краски в тромбоцитах одного донора варьируется между клетками. Для изучения данного феномена мы изучили специфичность каждой краски. Тромбоциты были иммобилизованы на VM64 (анти-CD31). Количество краски в тромбоците оценивалось по профилю в первые 15 секунд эксперимента. Тромбоциты одного донора загружались четырьмя разными флуоресцентными красками: CalBryte590-AM (Протокол З), DIOC6 (Протокол В), Fura Red-AM (Протокол Е) и Fluo-4-AM (Протокол Ж) (Рис. 4). Для всех красок наблюдалась гетерогенность базовой интенсивности флуоресценции с отклонением от медианного значения в 2-6 раз у 30% популяции. Интересно, что CalBryte590 (Рис. 4А) и Fluo-4-AM (Рис. 4В) загружаются более гомогенно, чем DIOC6 (Рис. 4Б) и Fura Red-AM (Рис. 4Г).
Наблюдаемый феномен специфической загрузки разных красок может быть связан с размером и полярностью флуоресцентных молекул. Наличие разности потенциалов на мембране тромбоцита
[
24,
Patch-clamp technique for studying ion channels in activated platelets

A. Kokhan, S. Zdanevich, I. Prokofev, I. Gorudko, E. Shamova

System Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 3-11

https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202101012

Article | Google Scholar

25
Calcium-activated potassium channels in human platelets.

M. Mahaut-Smith

The Journal of Physiology. 1995, 484, 15-24

https://doi.org/10.1113/jphysiol.1995.sp020644

Article | Google Scholar

]
способствует проникновению катионных красок и останавливает анионные. Тем не менее, гетерогенность потенциала в популяции может привести к гетерогенности прокрашивания. Так как DIOC6 – это заряд-чувствительная краска, которая не содержит -АМ часть, ее распределение в популяции тромбоцитов ярко отражает это свойство тромбоцитов (Рис. 4Б). Уже было показано, что Fluo-4 распределяется гетерогенно в тромбоцитах
[
26
A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals

D. Thomas, S. Tovey, T. Collins, M. Bootman, M. Berridge, P. Lipp

Cell Calcium. 2000, 28, 213-223

https://doi.org/10.1054/ceca.2000.0152

Article | Google Scholar

]
, что первично ассоциировано с компартментализацией краски. Как бы то ни было, причины этой гетерогенности не до конца понятны. Возможно, компартментализация краски может вызывать гетерогнность. Также известно, что низкая температура инкубации и использование сурфактантов снижает компартментализацию красок
[
27
Predicting and avoiding subcellular compartmentalization artifacts arising from acetoxymethyl ester calcium imaging probes. The case of fluo-3 AM and a general account of the phenomenon including a problem avoidance chart

K. Thompson, P. Dockery, R. Horobin

Biotechnic & Histochemistry. 2012, 87, 468-483

https://doi.org/10.3109/10520295.2012.703691

Article | Google Scholar

]
.
None
Figure 4. None
None
Figure 5. None
Чтобы выяснить причину неравномерного распределения флуоресцентных красок в тромбоцитах, мы использовали CellTracker Violet BMQC. Целью было визуализировать положение клетки в пространстве. Это вещество – производное кумарина, может свободно проникать в клетку и оставаться внутри нее на протяжении долгого времени благодаря связыванию с глутатионом. У нас нет данных, что интенсивность флуоресценции этой краски зависит от концентрации кальция в цитозоле, таким образом можно заключить, что на внедрение краски главным образом влияет состояние плазматической мембраны.

Загрузка флуоресцентной краски в тромбоциты зависит от экспериментальных условий.

Загрузка флуоресцентной краски может зависеть от условий инкубации. Для проверки мы сравнили количество краски в тромбоцитах при разных условиях загрузки: на комнатной температуре (протокол Б, см. Методы), в присутствие гидрофобных агентов (протокол Г) или при деплеции холестерола мембраны (протокол Д) (Рис. 5). Статистическая значимость в количестве «загруженной» краски была посчитана с использованием критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова (Таблица 1).
Все три образца не подчиняются тому же закону распределения, что и контроль. Тесты с MβCD и на 25оС показывают значимость с значением р<0,01, образец с Pluronic-127 на тесте Колмогорова-Смирнова имеет значение р<0,01, а на тесте Манна-Уитни – p<0,05.
None
Figure 6. None
Инкубация на комнатной температуре в сравнении с инкубацией на 37оС снижает среднюю и медианную интенсивности флуоресценции клеток больше, чем на 100%. Этот результат подтверждает данные, что проницаемость клеточной мембраны зависит от температуры
[
28
Using quin2 in cell suspensions

T. Rink, T. Pozzan

Cell Calcium. 1985, 6, 133-144

https://doi.org/10.1016/0143-4160(85)90040-5

Article | Google Scholar

]
.
Pluronic F-127 снижает среднее количество краски в тромбоците (на 240%) и медиану (на 23%). Верхняя граница 95% доверительного интервала увеличилась больше чем на 550%. Pluronic - это сурфактант, который увеличивает растворимость краски в АМ форме
[
29
Adsorption of Pluronic F-127 on Surfaces with Different Hydrophobicities Probed by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation

M. Nejadnik, A. Olsson, P. Sharma, H. van der Mei, W. Norde, H. Busscher

Langmuir. 2009, 25, 6245-6249

https://doi.org/10.1021/la9001169

Article | Google Scholar

]
. Таким образом, распределение краски в клетке становится более единообразным, и количество перекрашенных тромбоцитов возрастает (среднее значение увеличивается, медианное значение не изменяется).
Инкубация с MβCD снижает среднее (на 17,7%) и медиану (на 72,9%) интенсивности флуоресценции в сравнении с контрольными образцами. MβCD снижает текучесть мембраны тромбоцита за счет снижения концентрации холестерола
[
30
Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer

F. de Meyer, B. Smit

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009, 106, 3654-3658

https://doi.org/10.1073/pnas.0809959106

Article | Google Scholar

]
, при этом не приводя к активации клетки
[
31,
The association of thromboxane A2 receptor with lipid rafts is a determinant for platelet functional responses

A. Moscardó, J. Vallés, A. Latorre, M. Santos

FEBS Letters. 2014, 588, 3154-3159

https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.06.057

Article | Google Scholar

32
Role of in vitro cholesterol depletion in mediating human platelet aggregation

S. Grgurevich, R. Krishnan, M. White, L. Jennings

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2003, 1, 576-586

https://doi.org/10.1046/j.1538-7836.2003.00087.x

Article | Google Scholar

]
. Наблюдаемые количества краски показывают, что MβCD помогает краске проникать в клетку. Это ведет к предположению, что количество краски в клетке зависит от состояния мембраны.

MβCD укорачивает время загрузки флуоресцентной краски в клетки

Холестерол мембраны влияет на загрузку краски в тромбоциты. Для исследования этого феномена загрузка тромбоцитов была оценена с помощью CalBryte590 без MβCD (Протокол А) и в присутствие MβCD (Протокол Д) (Рис. 6). MβCD увеличивает скорость входа краски в клетку примерно в 2 раза. И увеличение интенсивности флуоресценции в цитозоле начинается в 2 раза быстрее, чем в контрольных условиях.
None
Figure 7. None

Количество краски в тромбоците коррелирует с его ответом на стимуляцию

Флуоресцентная краска неравномерно заходит в тромбоциты в популяции независимо от краски и условий инкубации. Но остается неизвестно, значим ли этот феномен для исследования кальциевой сигнализации в тромбоцитах. Для исследования мы проверили связь базовой интенсивности флуоресценции краски и активации тромбоцита (Рис. 7). Количество краски в тромбоците было оценено по профилю на первых 15 секундах эксперимента. Распределение тромбоцитов по группам активации было проведено по профилям, снятым в течение 5 минут. Рисунок 7 показывает полученную зависимость группы активации от количества краски («нижний» предел интенсивности флуоресценции CalBryte590 в клетке). Оказалось, что тромбоциты из четвертой активационной группы, в среднем, имели в 10 раз больше краски, чем тромбоциты из третьей группы. Это может объясняться возможной активацией тромбоцитов четвертой группы в момент начала наблюдения. Тем не менее, в тромбоцитах третьей группы было в 7 раз больше краски, чем в клетках второй группы. Во второй группе было в 1,5 раза больше краски, чем в тромбоцитах первой группы. Так как тромбоциты групп 1-3 имеют выраженный базовый уровень флуоресценции, мы можем заключить, что степень активации тромбоцитов коррелирует с количеством флуорофора.
None
Figure 8. None
Для прояснения данного феномена мы решили оценить возможность наличия тромбоцитов с заданным значением базовой флуоресценции в каждой из групп активации в доступном образце. Тромбоцит с высокой интенсивностью флуоресценции с большей вероятностью подвергнется «сильной» активации, чем тромбоцит с низким уровнем базовой флуоресценции.
Таким образом, можно заключить, что оценка ответа тромбоцитов с помощью измерения концентрации кальция (методом проточной цитофлуориметрии или спектрофлуориметрии) сдвинута в суспензии. Этот сдвиг появляется, потому что тромбоциты, которые сильно активированы, выходят вперед. Так, общий ответ суспензии становится сильнее, чем в физиологических условиях.
None
Figure 9. None
 

Заключение

Мы показали, что тромбоциты гетерогенно загружаются CalBryte590. Эта гетерогенность не случайна. Было обнаружено, что вероятность наблюдения «сильной» активации тромбоцита с высокой базовой интенсивностью флуоресценции выше, чем тромбоцита с низкой базовой флуоресценцией. Гетерогенность загрузки тромбоцита краской, так же, как и сам процесс загрузки, могут быть подвергнуты влиянию различных агентов и экспериментальных условий. Мы наблюдали это с краской CalBryte590-AM. Инкубация клеток с краской на 25оС, а не на 37оС замедляет загрузку. Pluronic-127 способствует более гомогенному распределению краски по клеткам и не влияет на мембрану тромбоцита. MβCD увеличивает интенсивность флуоресценции краски в цитозоле по сравнению с контролем. Также он увеличивает скорость загрузки краски в тромбоцит.
Гетерогенная загрузка клетки не уникальна для краски CalBryte590-AM. Мы показали, что флуоресцентные краски DIOC6 (3), Fura Red AM, Fluo-4 AM также гетерогенно загружаются в тромбоциты. Гетерогенность загрузки DIOC6 сравнима с другими красками и показывает, что на мембране тромбоцита разность потенциалов распределена гетерогенно. Предполагается, что это частично объясняет феномен гетерогенной загрузки краски в целом. Тем не менее, наши данные недостаточны для определения причины гетерогенности загрузки. Необходимо проводить дальнейшие исследования для изучения комбинаций эффектов параметров, которые были использованы. Также размер молекулы краски, ее квантово-химические свойства также представляют высокий интерес для исследования. Как бы то ни было, возможно идентифицировать несколько факторов, которые значимо влияют на количество флуоресцентной краски в живой клетке. Во-первых, состав плазматической мембраны играет важную роль. Мы показали, что низкомолекулярные гидрофобные вещества проходят через мембрану, когда в ней находится больше ненасыщенных жирных кислот. Количество загруженной краски зависит от температуры инкубации. Во-вторых, физико-химическое состояние краски вне клетки оказывает свой эффект. Более того, важна активность неспецифических эстераз, которые отрезают АМ-«хвосты». На чувствительность к активации клетки влияние оказывает больше, чем два фактора: наличие неспецифических каналов или переносчиков для обеих АМ-формы и рабочей формы, а также чувствительность к тому, как краска формирует разность потенциалов на мембране благодаря своему заряду.

 Финансирование

Данное исследование было финансировано грантом РФФИ и Королевского Общества Лондона, проект 21-51-10005

Библиографические ссылки статьи:

  1. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion

    M. Panteleev, N. Dashkevich, F. Ataullakhanov

    Thrombosis Research. 2015, 136, 699-711

    https://doi.org/10.1016/j.thromres.2015.07.025

    Article|Google Scholar

  2. Platelets and hemostasis

    Panteleev M.A., Sveshnikova A.N.

    Oncohematology. 2014, 9(2), 65-73

    https://doi.org/10.17650/1818-8346-2014-9-2-65-73

    Article|Google Scholar

  3. Platelet Integrin αIIbβ3: Mechanisms of Activation and Clustering; Involvement into the Formation of the Thrombus Heterogeneous Structure

    V. Kaneva, A. Martyanov, D. Morozova, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2019, 13, 97-110

    https://doi.org/10.1134/S1990747819010033

    Article|Google Scholar

  4. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

    A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

    Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

    https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202101014

    Article|Google Scholar

  5. Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation

    N. Topalov, Y. Kotova, S. Vasil’ev, M. Panteleev

    British Journal of Haematology. 2012, 157, 105-115

    https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2011.09021.x

    Article|Google Scholar

  6. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting

    N. Podoplelova, A. Sveshnikova, Y. Kotova, A. Eckly, N. Receveur, D. Nechipurenko, S. Obydennyi, I. Kireev, C. Gachet, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Blood. 2016, 128, 1745-1755

    https://doi.org/10.1182/blood-2016-02-696898

    Article|Google Scholar

  7. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

    D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

    https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.118.311390

    Article|Google Scholar

  8. PKC inhibition markedly enhances Ca2+ signaling and phosphatidylserine exposure downstream of protease-activated receptor-1 but not protease-activated receptor-4 in human platelets

    M. HARPER, A. POOLE

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 1599-1607

    https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2011.04393.x

    Article|Google Scholar

  9. Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

    A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

    https://doi.org/10.3390/ijms21093035

    Article|Google Scholar

  10. Monitoring the intracellular store Ca2+ concentration in agonist-stimulated, intact human platelets by using Fluo-5N

    S. SAGE, N. PUGH, M. MASON, A. HARPER

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 540-551

    https://doi.org/10.1111/j.1538-7836.2010.04159.x

    Article|Google Scholar

  11. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 2: receptors.

    A. Martyanov, M. Panteleev

    Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 13-30

    https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202103013

    Article|Google Scholar

  12. Why Calcium? How Calcium Became the Best Communicator

    E. Carafoli, J. Krebs

    Journal of Biological Chemistry. 2016, 291, 20849-20857

    https://doi.org/10.1074/jbc.R116.735894

    Article|Google Scholar

  13. The calcium-signalling saga: tap water and protein crystals

    E. Carafoli

    Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003, 4, 326-332

    https://doi.org/10.1038/nrm1073

    Article|Google Scholar

  14. Transient Receptor Potential Channels Function as a Coincidence Signal Detector Mediating Phosphatidylserine Exposure

    M. Harper, J. Londoño, K. Quick, J. Londoño, V. Flockerzi, S. Philipp, L. Birnbaumer, M. Freichel, A. Poole

    Science Signaling. 2013, 6,

    https://doi.org/10.1126/scisignal.2003701

    Article|Google Scholar

  15. Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

    A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

    https://doi.org/10.1111/jth.13442

    Article|Google Scholar

  16. Roles of phospholipase C and Ca(2+)-ATPase in calcium responses of single, fibrinogen-bound platelets.

    J. Heemskerk, P. Vis, M. Feijge, J. Hoyland, W. Mason, S. Sage

    Journal of Biological Chemistry. 1993, 268, 356-363

    https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)54158-2

    Article|Google Scholar

  17. Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets

    J. Heemskerk, J. Hoyland, W. Mason, S. Sage

    Biochemical Journal. 1992, 283, 379-383

    https://doi.org/10.1042/bj2830379

    Article|Google Scholar

  18. Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation

    S. Obydennyy, A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 1867-1881

    https://doi.org/10.1111/jth.13395

    Article|Google Scholar

  19. Photophysics of Fluorescent Probes for Single-Molecule Biophysics and Super-Resolution Imaging

    T. Ha, P. Tinnefeld

    Annual Review of Physical Chemistry. 2012, 63, 595-617

    https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-032210-103340

    Article|Google Scholar

  20. Measurement of Intracellular Calcium

    A. Takahashi, P. Camacho, J. Lechleiter, B. Herman

    Physiological Reviews. 1999, 79, 1089-1125

    https://doi.org/10.1152/physrev.1999.79.4.1089

    Article|Google Scholar

  21. Clusterization of Inositol Trisphosphate Receptors Determines the Shape of the Calcium Oscillation Peak in Platelet Cytosol

    F. Balabin, D. Morozova, A. Mayorov, A. Martyanov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Moscow University Physics Bulletin. 2018, 73, 526-533

    https://doi.org/10.3103/S0027134918050041

    Article|Google Scholar

  22. A Monoclonal Antibody, VM64, Reacts with a 130 kDa Glycoprotein Common to Platelets and Endothelial Cells: Heterogeneity in Antibody Binding to Human Aortic Endothelial Cells

    A. Mazurov, D. Vinogradov, N. Kabaeva, G. Antonova, Y. Romanov, T. VIasik, A. Antonov, V. Smirnov

    Thrombosis and Haemostasis. 1991, 66, 494-499

    https://doi.org/10.1055/s-0038-1646445

    Article|Google Scholar

  23. Quantitative Assessment of Heterogeneity of Single Platelet Calcium Responses to Activation

    Balabin FA.

    Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2021, 5, PB1027

    Google Scholar

  24. Patch-clamp technique for studying ion channels in activated platelets

    A. Kokhan, S. Zdanevich, I. Prokofev, I. Gorudko, E. Shamova

    System Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 3-11

    https://doi.org/10.52455/sbpr.01.202101012

    Article|Google Scholar

  25. Calcium-activated potassium channels in human platelets.

    M. Mahaut-Smith

    The Journal of Physiology. 1995, 484, 15-24

    https://doi.org/10.1113/jphysiol.1995.sp020644

    Article|Google Scholar

  26. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals

    D. Thomas, S. Tovey, T. Collins, M. Bootman, M. Berridge, P. Lipp

    Cell Calcium. 2000, 28, 213-223

    https://doi.org/10.1054/ceca.2000.0152

    Article|Google Scholar

  27. Predicting and avoiding subcellular compartmentalization artifacts arising from acetoxymethyl ester calcium imaging probes. The case of fluo-3 AM and a general account of the phenomenon including a problem avoidance chart

    K. Thompson, P. Dockery, R. Horobin

    Biotechnic & Histochemistry. 2012, 87, 468-483

    https://doi.org/10.3109/10520295.2012.703691

    Article|Google Scholar

  28. Using quin2 in cell suspensions

    T. Rink, T. Pozzan

    Cell Calcium. 1985, 6, 133-144

    https://doi.org/10.1016/0143-4160(85)90040-5

    Article|Google Scholar

  29. Adsorption of Pluronic F-127 on Surfaces with Different Hydrophobicities Probed by Quartz Crystal Microbalance with Dissipation

    M. Nejadnik, A. Olsson, P. Sharma, H. van der Mei, W. Norde, H. Busscher

    Langmuir. 2009, 25, 6245-6249

    https://doi.org/10.1021/la9001169

    Article|Google Scholar

  30. Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer

    F. de Meyer, B. Smit

    Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009, 106, 3654-3658

    https://doi.org/10.1073/pnas.0809959106

    Article|Google Scholar

  31. The association of thromboxane A2 receptor with lipid rafts is a determinant for platelet functional responses

    A. Moscardó, J. Vallés, A. Latorre, M. Santos

    FEBS Letters. 2014, 588, 3154-3159

    https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.06.057

    Article|Google Scholar

  32. Role of in vitro cholesterol depletion in mediating human platelet aggregation

    S. Grgurevich, R. Krishnan, M. White, L. Jennings

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2003, 1, 576-586

    https://doi.org/10.1046/j.1538-7836.2003.00087.x

    Article|Google Scholar