Русский

Функциональные ответы тромбоцитов и внутриклеточная сигнализация: молекулярные взаимоотношения. Часть 2: Рецепторы.

Введение

Тромбоциты - клетки крови, играющие ключевую роль в процессе остановки кровотечения

, а также в формировании гемостатической пробки при травме
[
2
Novel mouse hemostasis model for real-time determination of bleeding time and hemostatic plug composition

T. Getz, R. Piatt, B. Petrich, D. Monroe, N. Mackman, W. Bergmeier

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 417-425

]
, поддержании целостности сосудов
и модуляции иммунных ответов
[
6,
Platelet ITAM signaling is critical for vascular integrity in inflammation

Yacine Boulaftali, Paul R. Hess, Todd M. Getz, Agnieszka Cholka, Moritz Stolla, Nigel Mackman, A. Phillip Owens III, Jerry Ware, Mark L. Kahn, Wolfgang Bergmeier

The Journal of Clinical Investigation. 2013, 123 (2), 908-916

7,
Editorial: Platelets and Immune Responses During Thromboinflammation

M. Schattner, C. Jenne, S. Negrotto, B. Ho-Tin-Noe

Frontiers in Immunology. 2020, 11, None

8
The dual role of platelet-innate immune cell interactions in thrombo-inflammation

J. Rayes, J. Bourne, A. Brill, S. Watson

Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2020, 4, 23-35

]
. Белковый состав тромбоцитов заранее детерминирован, хотя небольшой синтез белка все-таки возможен
. Тем не менее, основные функциональные ответы тромбоцита (рисунок 1) от синтеза белка не зависят
[
10
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

]
.

Первым ответом тромбоцита на встречу с активатором является изменение формы:

дисковидные клетки значительно увеличивают площадь своей поверхности за счет «вызволения» мембраны, сложенной внутри в виде открытой канальцевой системы

[
11
Platelets: production, morphology and ultrastructure

Thon JN, Italiano JE

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 3-22

]
. Изменение формы происходит в несколько стадий
[
12
Platelet shape change and spreading

Aslan JE, Itakura A, Gertz JM, McCarty OJT

Methods in Molecular Biology. 2012, 788, 91-100

]
: деполимеризация микротрубочек
[
13,
Tubulin in Platelets: When the Shape Matters

E. Cuenca-Zamora, F. Ferrer-Marín, J. Rivera, R. Teruel-Montoya

International Journal of Molecular Sciences. 2019, 20, 3484

]
, перестройка актинового цитоскелета
[
15
Actin dynamics in platelets

Bearer EL, Prakash JM, Li Z.

International Review of Cytology. 2002, 217, 137-82

]
и формирование сначала филоподий, а затем ламеллоподий
[
12
Platelet shape change and spreading

Aslan JE, Itakura A, Gertz JM, McCarty OJT

Methods in Molecular Biology. 2012, 788, 91-100

]
. При наличии поверхности наблюдается распластывание, в основном за счёт перестроения актинового цитоскелета
[
12,
Platelet shape change and spreading

Aslan JE, Itakura A, Gertz JM, McCarty OJT

Methods in Molecular Biology. 2012, 788, 91-100

]
.

Возможно, ключевым функциональным ответом тромбоцита является переход в проагрегантное состояние, при котором тромбоцитарные интегрины αIIbβ3

переходят в высокоаффинное к фибриногену состояние
[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
и обеспечивают «слипание» тромбоцитов через мостики «αIIbβ3 – фибриноген – αIIbβ3»
. Путь от рецепторов к активации интегринов называют «inside-out», в то время как усиление активации тромбоцитов, при котором интегрины выступают уже в роли рецепторов – «outside-in»
.

Важным функциональным ответом тромбоцита является дегрануляция

[
10
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

]
. Тромбоциты содержат три типа гранул: α- и δ-гранулы и лизосомы, при этом считается, что выход aльфа-гранул происходит при более слабой стимуляции, в то время как выход плотных гранул – признак сильной активации тромбоцита
. a-гранулы содержат в себе разнообразные белки, гликопротеины и хемокины, а плотные (δ) гранулы - прежде всего низкомолекулярные вещества и ионы
. Весь секретом тромбоцита играет важнейшую роль для вторичной активации тромбоцитов, для регуляции просвета сосуда и иммунного ответа
[
10
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

]
.

В некоторых условиях, например, при двойной стимуляции тромбоцитов тромбином и коллагеном, происходит митохондриально-зависимый некроз субпопоуляции тромбоцитов, которые при этом теряют способность к агрегации, экспонируют отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин, который является одним из посадочных сайтов для комплексов теназы и протромбиназы, что значительно ускоряет работы каскада свертывания плазмы крови

[
23,
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

24
Procoagulant Platelets Form an α-Granule Protein-covered “Cap” on Their Surface That Promotes Their Attachment to Aggregates

A. Abaeva, M. Canault, Y. Kotova, S. Obydennyy, A. Yakimenko, N. Podoplelova, V. Kolyadko, H. Chambost, A. Mazurov, F. Ataullakhanov, A. Nurden, M. Alessi, M. Panteleev

Journal of Biological Chemistry. 2013, 288, 29621-29632

]
. Эта популяция получила название «прокоагулянтной». Предполагается, что большое количество прокоагулянтных тромбоцитов в ядре тромба способствует ускорению полимеризации фибрина, которая укрепляет тромб
[
25,
Regulating thrombus growth and stability to achieve an optimal response to injury

L. BRASS, K. WANNEMACHER, P. MA, T. STALKER

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 66-75

26
Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

]
. Переходы тромбоцитов между различными состояниями при разной степени активации приведены на рисунке 1.
Разные степени активации тромбоцитов при гемостазе. При слабой активации тромбоциты переходят в слабоактивированное состояние, при котором не происходит кластеризации тромбоцитарных интегринов и значимое изменение формы тромбоцитов. Данная слабая активация является обратимой и соответствует состоянию тромбоцитов в «шубе» тромба. При более сильной активации происходит значительное изменение формы, необратимая активация и агрегация тромбоцитов. Также происходит секреция тромбоцитарных гранул. При максимальной степени активации происходит коллапс митохондрий тромбоцитов и тромбоциты переходят в прокоагулянтное состояние, выставляя фосфатидилсерин. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты значительно ускоряют плазменное звено гемостаза.
Figure 1. Разные степени активации тромбоцитов при гемостазе. При слабой активации тромбоциты переходят в слабоактивированное состояние, при котором не происходит кластеризации тромбоцитарных интегринов и значимое изменение формы тромбоцитов. Данная слабая активация является обратимой и соответствует состоянию тромбоцитов в «шубе» тромба. При более сильной активации происходит значительное изменение формы, необратимая активация и агрегация тромбоцитов. Также происходит секреция тромбоцитарных гранул. При максимальной степени активации происходит коллапс митохондрий тромбоцитов и тромбоциты переходят в прокоагулянтное состояние, выставляя фосфатидилсерин. Таким образом, прокоагулянтные тромбоциты значительно ускоряют плазменное звено гемостаза.

Огромная сеть рецепторов и путей передачи сигналов тромбоцитов регулирует реализацию перечисленных функций ровно в том месте и в тот момент времени, когда это необходимо

[
10
Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

]
. Как же это работает? Оказывается, что основные принципы передачи информации применимы и к живым клеткам. А именно, в системе должен быть «источник», «передатчик» и «приемник» (Рис. 2). С точки зрения тромбоцита, внешний сигнал обрабатывается рецепторами, которые передают сигналы внутрь клетки на, передатчики – вторичные мессенджеры. В настоящем обзоре мы сосредоточимся на анализе, как различные активаторы тромбоцитов регулируют концентрации вторичных мессенджеров, которые, в свою очередь и регулируют перечисленные функциональные ответы, о чем речь пойдет в третьей статье из настоящей серии.

Схема передачи сигнала внутри безъядерной клетки. Из внеклеточной среды поступает некоторый «сигнал», который активирует рецептор. Это приводит к производству вторичных мессенджеров, которые, проходя через «усиление», запускают промежуточные, а затем, и функциональные ответы. При этом в системе присутствуют регуляторы, которые выполняют роль положительных или отрицательных обратных связей.
Figure 2. Схема передачи сигнала внутри безъядерной клетки. Из внеклеточной среды поступает некоторый «сигнал», который активирует рецептор. Это приводит к производству вторичных мессенджеров, которые, проходя через «усиление», запускают промежуточные, а затем, и функциональные ответы. При этом в системе присутствуют регуляторы, которые выполняют роль положительных или отрицательных обратных связей.

Вторичные мессенджеры в тромбоцитах

Рецепторная сеть тромбоцитов может быть грубо разделена на несколько подсетей, каждая из которых управляется своим набором вторичных мессенджеров, которые, в некоторых случаях, могут перекликаться. Можно утверждать, что вторичные мессенджеры находятся в центре внутриклеточной сигнализации: они «собирают» информацию с рецепторов и «передают» ее функциональным системам. Поэтому в настоящей статье мы рассмотрим, как именно регулируется концентрация вторичных мессенджеров в тромбоците. При этом следует не забывать о том, что тромбоцит – безъядерная клетка, т.е. регуляции, ведущей к синтезу белка у нее нет. Далее мы кратко перечислим основные вторичные мессенджеры тромбоцита.

Согласно мнению многих исследователей \cite[27, 28, 29}, с которым мы согласны, ключевым вторичным мессенджером в тромбоците являются свободные ионы кальция цитозоле. В покое она поддерживается низкой мембранными АТФазами PMCA и SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase)

[
23,
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

30
Control of Platelet CLEC-2-Mediated Activation by Receptor Clustering and Tyrosine Kinase Signaling

A. Martyanov, F. Balabin, J. Dunster, M. Panteleev, J. Gibbins, A. Sveshnikova

Biophysical Journal. 2020, 118, 2641-2655

]
, которые «выкачивают» кальций из цитозоля соответственно наружу клетки или во внутриклеточные хранилища
[
23,
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

29
Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation

S. Obydennyy, A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 1867-1881

]
. Мобилизация (т.е. выход) кальция может происходить за счет открытия многочисленных и разнообразных мембранных каналов
[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
. Обычно, основным сигналом, управляющим концентрацией кальция в тромбоците, считается инозитол-1,4,5-трифосфат (inositol-1,4,5-triphosphate, IP3), возникающий в результате работы фосфолипазы С на плазматической мембране и активирующий каналы-рецепторы к IP3, IP3R
[
32
Calcium signaling in platelets

D. VARGA-SZABO, A. BRAUN, B. NIESWANDT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009, 7, 1057-1066

]
. Как показали исследования кальциевой сигнализации в одиночных клетках, повышение концентрации кальция при активации тромбоцита происходит не равномерно, а в виде отдельных спайков [29,33], которые сливаются друг с другом, возможно, из-за кластеризации IP3R
[
34
Mechanisms of increased mitochondria-dependent necrosis in Wiskott-Aldrich syndrome platelets

S. Obydennyi, E. Artemenko, A. Sveshnikova, A. Ignatova, T. Varlamova, S. Gambaryan, G. Lomakina, N. Ugarova, I. Kireev, F. Ataullakhanov, G. Novichkova, A. Maschan, A. Shcherbina, M. Panteleev

Haematologica. 2020, 105, 1095-1106

]
.

В то время как основным хранилищем для ионов кальция в тромбоцитах является эндоплазматический ретикулум, при кальциевых спайках также может происходить закачивание кальция в митохондрии тромбоцитов через кальциевый унипортер. Кальций также может откачиваться из митохондрий через насос NCLX

[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
. Однако, при сильной активации может происходить перегрузка митохондрий кальцием, падение митохондриального потенциала, открытие митохондриальной поры и коллапс митохондрий. Всё это приводит к некрозу и превращению тромбоцита в прокоагулянтный
[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
. Например, показано, что если в тромбоцитах меньшее количество митохондрий, то они становятся более склонными к переходу в прокоагулянтное состояние
. Также существуют гипотезы о изначальной пре-детерминированности части тромбоцитов к переходу в прокоагулянтное состояние, что также может быть связано с количеством их митохондрий
[
36
Программируемая клеточная смерть и функциональная активность тромбоцитов при онкогематологических заболеваниях

А. Мартьянов, А. Игнатова, Г. Свидельская, Е. Пономаренко, С. Гамбарян, А. Свешникова, М. Пантелеев

Биохимия. 2020, 85, 1489-1499

]
. Прокоагулянтные тромбоциты могут формироваться не только по пути некроза, но и по классическому пути митохондрий зависимого апоптоза, индуцируемого, например, ингибиторами Bcl-белков (например, ABT-737)
.

IP3 также считается вторичным мессенджером, так как образуется в результате активности фосфолипазы С вместе с диацилглицеролом из мембранного фосфолипида, фосфоинозитид-4,5-бисфосфата (phosphoinositide-4,5-bisphosphate, PIP2). Интересно, что концентрация IP3 в цитозоле тромбоцита зависит еще и от активности фермента IP3-3-киназы (IP3K)

[
38
Glutamate regulation of calcium and IP3 oscillating and pulsating dynamics in astrocytes

M. De Pittà, M. Goldberg, V. Volman, H. Berry, E. Ben-Jacob

Journal of Biological Physics. 2009, 35, 383-411

]
. IP3K катализирует фосфорилирование IP3, тем самым непосредственно уменьшая количество вторичных мессенджеров, доступных для взаимодействия с IP3R. Согласно
, IP3K активируется высокими концентрациями кальмодулина, связанного с кальцием, которые доступны только при высокой концентрации цитозольного кальция (> 1 мкМ). Предполагается, что при активации тромбоцита концентрации IP3 достигают 1-2 мкМ (такой концентрации достаточно для полного открытия IP3R
[
23,
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
), однако следует иметь ввиду, что экспериментальные данные об абсолютной концентрации инозитол-1,4,5-трифосфата в тромбоцитах отсутствуют (несмотря на то, что это наиболее активная форма IP3, во внутриклеточной сигнализации наблюдаются и другие формы, в первую очередь инозитол-1,3,4-трифосфат, концентрация которого может быть гораздо выше, а экспериментальное разделение этих веществе затруднительно)
.

Сопоставимым по важности с кальцием вторичным мессенджером является мембранная концентрация фосфолипида фосфоинозитид-3,4,5-трифосфата (phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate, PIP3). Фосфорилированные остатки инозитида – фосфоинозитиды – составляют 10-15% липидного состава внутреннего слоя плазматической мембраны тромбоцитов

. Среди мембранных фосфоинозитидов в покоящихся тромбоцитах больше всего содержится PIP2, который синтезируются из фосфоинозитид-4-фосфата за счёт активности фосфатидилинозитид-4-фосфат-5-киназы (PI4,5K)
. PIP2 может самостоятельно выполнять функции докингового сайта для посадки белков на мембраны: PIP2 является посадочным сайтом для талина – ключевого белка, необходимого для ассоциации тромбоцитарных интегринов - и актинового цитоскелета
[
42,
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

43
Platelets lacking PIP5KIγ have normal integrin activation but impaired cytoskeletal-membrane integrity and adhesion

Y. Wang, L. Zhao, A. Suzuki, L. Lian, S. Min, Z. Wang, R. Litvinov, T. Stalker, T. Yago, A. Klopocki, D. Schmidtke, H. Yin, J. Choi, R. McEver, J. Weisel, J. Hartwig, C. Abrams

Blood. 2013, 121, 2743-2752

]
. Исследования в дефицитных по специфическим изоформам PIP5K мышах показывают, что внутри мембраны тромбоцитов существуют несколько отдельных пулов PIP2; PIP2, производимый PIP5Kγ, важен для прикрепления мембраны к нижележащему цитоскелету, в то время как PIP2, синтезируемый PIP5Kα и PIP5Kβ, используется в качестве субстрата для вторичных мессенджеров
[
44
The role of class I, II and III PI 3-kinases in platelet production and activation and their implication in thrombosis

C. Valet, S. Severin, G. Chicanne, P. Laurent, F. Gaits-Iacovoni, M. Gratacap, B. Payrastre

Advances in Biological Regulation. 2016, 61, 33-41

]
. PIP2 является субстратом для 2х ключевых для внутриклеточной сигнализации тромбоцита ферментов, PLC и PI3K, о которых речь пойдет ниже. Фосфоинозитид-3-киназа (phosphoinositide-3-kinase, PI3K), фосфорилирует различные фосфоинозитиды по 3-му атому углерода. Из ее продуктов особую роль играет PIP3
. PIP3, как и PIP2, узнаются особыми PH-доменами белков, а также его узнают PX и FYVE домены. Фосфоинозитидная сигнализация связана с посадкой на мембрану и активацией белков, содержащих PH-домены, например, PLCγ2, Btk/Tec и серин/треонин киназа Akt
[
46
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

]
. Фактически, фосфорилирование Akt является наиболее масштабным эффектором PI3K-зависимой генерации PIP3 в тромбоцитах. Примечательно, что киндлин 3, компонент комплекса активации тромбоцитарных интегринов, который контролирует авидность интегринов к фибриногену, имеет атипичный домен FERM, также содержащий домен PH
[
47
Different roles of SHIP1 according to the cell context: The example of blood platelets

M. Gratacap, S. Séverin, G. Chicanne, M. Plantavid, B. Payrastre

Advances in Enzyme Regulation. 2008, 48, 240-252

]
. Кластеры PIP3 можно считать центрами внутриклеточной сигнализации
[
42
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

]
. В обратную сторону фосфоинозитидная сигнализация в тромбоцитах регулируется липидными фосфатазами (PTEN, SHIP1, SHIP2), которые, снижая уровень PIP3, подавляют PI3K-зависимую активацию тромбоцитов
[
48
SH2-containing inositol 5-phosphatases 1 and 2 in blood platelets: their interactions and roles in the control of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate levels

S. GIURIATO, X. PESESSE, S. BODIN, T. SASAKI, C. VIALA, E. MARION, J. PENNINGER, S. SCHURMANS, C. ERNEUX, B. PAYRASTRE

Biochemical Journal. 2003, 376, 199-207

]
. В частности, для мышей, SHIP1 играет главную роль в контроле высоких концентраций PIP3
[
49
Deficiency of Src homology 2 domain–containing inositol 5-phosphatase 1 affects platelet responses and thrombus growth

S. Séverin, M. Gratacap, N. Lenain, L. Alvarez, E. Hollande, J. Penninger, C. Gachet, M. Plantavid, B. Payrastre

Journal of Clinical Investigation. 2007, 117, 944-952

]
, однако, ее дефицит не влияет на «inside-out» активацию интегринов
[
50
Effects of bacterial lipopolysaccharides on platelet function: inhibition of weak platelet activation

A. Martyanov, A. Maiorov, A. Filkova, A. Ryabykh, G. Svidelskaya, E. Artemenko, S. Gambaryan, M. Panteleev, A. Sveshnikova

Scientific Reports. 2020, 10, None

]
.

Последним промежуточным посредником активации, а, точнее, ингибирования тромбоцита является концентрация в цитозоле циклических нуклеотидов – cAMP и cGMP

[
]
. Циклические нуклеотиды генерируются циклазами: аденилат-циклазой (cAMP из ATP) и гуанилат-циклазой (cGMP из GTP) и превращаются в моно-фосфорибонуклеотиды низкоспецифичными фосфодиэстеразами (PDE)
. В то время как активность PDE регулируется преимущественно доступностью субстратов, активность циклаз может быть как увеличена, так и уменьшена под действием внешних сигналов, таким образом, концентрация циклических нуклеотидов в тромбоцитах может изменяться в обе стороны
. Увеличение количества cAMP в клетке приводит к активации cAMP-зависимой протеинкиназы A (PKA)
. Активированная PKA фосфорилирует многие регуляторные белки, такие как VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein). Кроме того, PKA опосредованно регулирует кальциевую сигнализацию, фосфорилируя IP3R и PMCA
[
]
. Известно, что повышение уровня cAMP подавляет все функциональные ответы тромбоцитов, однако механизмы этого подавления изучены поверхностно. Возможно, фосфо-протеомика тромбоцитов в ответ на форсколин (активатор АС) тут даст ответы
.

Рецепторы, ассоциированные с G-белками

Примерно половину тромбоцитарных рецепторов составляют рецепторы-серпентины, иначе называемые 7TM-рецепторы или рецепторы, ассоциированные с G-белками (G-protein coupled receptors, GPCR)

[
55
Kinetic diversity in G-protein-coupled receptor signalling

V. Katanaev, M. Chornomorets

Biochemical Journal. 2007, 401, 485-495

]
. GPCR составляют одно из самых больших семейств белков у человека. GPCR распознают самые разнообразные по природе внеклеточные сигналы и управляют множеством клеточных и организменных реакций
. GPCR передают сигналы внутрь клетки посредством активации тримерных G-белков. Эти белки в состоянии покоя существуют как гетеротримеры α, β и γ субъединиц, где α-субъединица связана с GDP. Комплекс GαGDPβγ может ассоциироваться с GPCR. При связывании с внеклеточным лигандом, GPCR активируется и функционирует как GEF (Guanine-nucleotide Exchange Factor) для G-белков, катализируя обмен ассоциированного с α-субъединицей GDP на GTP. Это приводит к диссоциации комплекса на активированный GPCR, GαGTP и βγ, которые могут независимо передавать сигналы различным нижестоящим эффекторам. Со временем GTP на Gα гидролизуется обратно к GDP посредством собственной GTPазной-активности Gα или с помощью GAP (GTPase-activating protein). GAP-подобной активностью обладают прямые мишени GαGTP, например, PLCβ (фосфолипаза Cβ), или специализированные белки семейства RGS (Regulator of G-protein Signalling)
[
57
A quantitative characterization of the yeast heterotrimeric G protein cycle

T. Yi, H. Kitano, M. Simon

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003, 100, 10764-10769

]
. GαGDP может связывать βγ и восстанавливать исходный комплекс. Считается, что активация рецептора приводит к значительному увеличению стационарных концентраций свободного GαGTP и βγ и соответствующему внутриклеточному сигналу. Через некоторое время активация спадает в результате исчезновения лиганда
или удаления рецептора с поверхности клетки (десенсетизация за счет интернализации)
, в некоторых случаях происходит ковалентное расцепление рецептора с G-белками. Однородность активации G-белка с помощью GPCR поднимает проблему специфичности в сигнале GPCR, рассматриваемую в работах группы В.Л. Катанаева и соавторов
[
60,
Double Suppression of the Gα Protein Activity by RGS Proteins

C. Lin, A. Koval, S. Tishchenko, A. Gabdulkhakov, U. Tin, G. Solis, V. Katanaev

Molecular Cell. 2014, 53, 663-671

61,
High capacity in G protein-coupled receptor signaling

A. Keshelava, G. Solis, M. Hersch, A. Koval, M. Kryuchkov, S. Bergmann, V. Katanaev

Nature Communications. 2018, 9, None

62
G PROTEIN βγ SUBUNITS

D. Clapham, E. Neer

Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 1997, 37, 167-203

]
. Эта проблема усугубляется разнородностью в передаче сигналов GPCR: рецепторы и эффекторы обычно не различают различные субъединицы βγ
, более того, рецепторы могут активировать G-белки, содержащие различные субъединицы Gα
. Ферментов, активируемых G-белками или просто локализуемых G-белками у мембраны, довольно много, мы рассмотрим только самые важные для активации тромбоцита.

В связи с важностью кальциевой сигнализации, мы начнем с фосфолипазы Cβ (phospholipase C, PLCβ), которая гидролизует PIP2 до инозитол 3,4,5 трифосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG). Активация PLCβ состоит в ее локализации у плазматической мембраны и субстратов

, можно даже утверждать, что чем дольше PLC находится около мембраны, тем выше ее активность. Ключевым фактором, держащим PLCβ около мембраны, является GαGTP типа q
[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
. Однако, Gβγ также способны самостоятельно удержать PLCβ (особенно PLCβ типа 3) около мембраны, а вместе с α-субъединицей усиление может составить более 6-10 раз
[
57
A quantitative characterization of the yeast heterotrimeric G protein cycle

T. Yi, H. Kitano, M. Simon

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003, 100, 10764-10769

]
. Кроме того, для PLC известна важная активация концентрацией внутриклеточного кальция
. Согласно
, PLC имеет несколько Ca2+ -связывающих сайтов, но только один из них является каталитическим
[
69
Activation of phospholipase C-beta 2 mutants by G protein alpha q and beta gamma subunits

Lee SB, Shin SH, Hepler JR, Gilman AG, Rhee SG.

Journal of Biological Chemistry. 1993, 268, 25952–7

]
. Согласно
, PLC мутантного типа, в котором отсутствуют все кальций связывающие сайты, кроме каталитического цилиндра TIM, имеет сходную кинетику с диким типом, то есть описывается уравнением Хилла с положительной кооперативностью. Согласно данным протеомики
, в тромбоците примерно по 2000 копий PLCβ2 и PLCβ3, что, при числе оборотов PLC 200-400 с-1 способно создать резкий подъем концентрации IP3 в цитозоле. Вторым продуктом работы PLC является диацилглицерол (DAG) [46], который остаётся в мембране и становится важным докинговым сайтом для многих ферментов, содержащих C1 домен
[
]
. Наиболее важными ферментами, активируемыми DAG, являются серин/треонин киназы типа С (protein kinase C, PKC), различные изоформы которых активируются связыванием с DAG и, иногда, с кальцием, что ведёт к активации, дегрануляции и изменению формы тромбоцитов
[
]
. Человеческие тромбоциты также экспрессируют несколько диацилглицерол-киназ (DGK), ответственных за форсфорилирование DAG. Известно, что ингибирование DGK ослабляет кальциевые ответы тромбоцитов на активацию, что подчёркивает значимость DAG для внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах
[
73
Heterodimeric Phosphoinositide 3-Kinase Consisting of p85 and p110β Is Synergistically Activated by the βγ Subunits of G Proteins and Phosphotyrosyl Peptide

H. Kurosu, T. Maehama, T. Okada, T. Yamamoto, S. Hoshino, Y. Fukui, M. Ui, O. Hazeki, T. Katada

Journal of Biological Chemistry. 1997, 272, 24252-24256

]
.

Вторым ферментом, активируемым G-белками, мы назовем фосфоинозитид-3-киназу типа γ (PI3Kγ). Наиболее охарактеризованными членами семейства PI3K являются PI3K класса I, которые представляют собой гетеродимерные белки: они состоят из каталитической субъединицы (p110α, p110β или p110δ), связанной с SH2-содержащей регуляторной субъединицей (пять вариантов, среди которых p85α является наиболее распространенным). Среди перечисленных субъединиц, p110β ассоциируется с плазматической мембраной через субъединицы Gβγ. PI3K класса IB (PI3Kγ) состоит из каталитической субъединицы p110γ, связанной с регуляторной субъединицей (p84), которая также активируется путем связывания с субъединицей Gβγ

[
74
Dichotomous regulation of myosin phosphorylation and shape change by Rho-kinase and calcium in intact human platelets

M Bauer, M Retzer, J I Wilde, P Maschberger, M Essler, M Aepfelbacher, S P Watson, W Siess

Blood. 1999, None, 1665–72

]
. Наибольшее значение для тромбоцита имеет активация PI3K от P2Y12
[
42
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

]
, так как при его активации высвобождается наибольшее количество субъединиц Gβγ.

G12/13-белок активирует RhoA (GTPases Ras homolog gene family, member A) и Rho-киназы. Активированная Rho-киназа стимулирует фосфорилирование легких цепей миозина MLC (Myosin Light Chain)

, таким образом, участвуя в изменении формы цитоскелета. Кроме того, RhoA напрямую участвует в секреции гранул
[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
.

Последний белок, активность которого в тромбоцитах управляется G-белками, как ни парадоксально – аденилатциклаза (AC)

[
76,
G-Protein–Coupled Receptors Signaling Pathways in New Antiplatelet Drug Development

P. Gurbel, A. Kuliopulos, U. Tantry

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2015, 35, 500-512

77
Fueling Platelets

S. Whiteheart

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2017, 37, 1592-1594

]
. Парадокс здесь связан с тем, что AC управляет концентрацией cAMP и для многих клеток, например, для миоцитов, является главным ферментом в регуляции энергетического метаболизма. Так как тромбоциты живут всего несколько дней, значимость запасов гликогена и активности гликолиза/окислительного фосфорилирования в тромбоцитах под вопросом
[
78
Signaling through Gi Family Members in Platelets

J. Yang, J. Wu, H. Jiang, R. Mortensen, S. Austin, D. Manning, D. Woulfe, L. Brass

Journal of Biological Chemistry. 2002, 277, 46035-46042

]
. Как было описано выше, в тромбоцитах основная роль AC состоит в управлении концентрацией cAMP. В тромбоцитах доминирует AC типа 3 – мембранный фермент, активируемый при связывании с αGTP-субъединицей Gs и ингибируемый при связывании с αGTP-субъединицей Gi или Gz
[
79
G-Protein Coupled Receptor Resensitization - Appreciating the Balancing Act of Receptor Function

M. L. Mohan, N. T. Vasudevan, M. K. Gupta, E. E. Martelli, S. V. Naga Prasad

Current Molecular Pharmacology. 2013, 5, 350-361

]
.

Одной из интересных особенностей GPCR-рецепторов является возможность их десенсетизации в результате контакта с активатором

[
80,
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

81
Domains specifying thrombin–receptor interaction

T. Vu, V. Wheaton, D. Hung, I. Charo, S. Coughlin

Nature. 1991, 353, 674-677

]
. Считается, что десенсетизация необходима клеткам для того, чтобы регулировать их ответы на тонические сигналы, которые могут приводить к патологической гиперактивации и гибели
[
80
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

]
. При активации GPCR-рецептора и диссоциации Ga от Gbg сам по себе GPCR может быть фосфорилирован G-белок ассоциированными киназами (GRK). Это приводит к посадке на GPCR b-аррестина и клатрина. Важную роль в процессе десенсетизации также играет PI3K, также как и b-аррестин присоединяются к фосфорилированным GRK GPCR, активруются и нарабатывают PIP3, необходимый для привлечения адаптерного белка AP-2. AP-2, клатрин и b-аррестин запускают «эндоцитоз» GPCR-рецептора
[
80
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

]
. Таким образом рецептор оказывается недоступен как для агониста, так и для G-белков. Десенсетизация GPCR является обратимой: при интернализации происходит диссоциация AP-2 и клатрина, что снижает аффинность b-аррестина к фосфорилрованным молекулам GPCR
[
80
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

]
. Это позволяет неспецифическим фосфатазам (таким как PP2) дефосфорилировать GPCR. Дефосворилированные GPCR возвращаются на плазматическую мембрану тромбоцита и снова могут образовывать комплексы с G-белками
[
80,
Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

81
Domains specifying thrombin–receptor interaction

T. Vu, V. Wheaton, D. Hung, I. Charo, S. Coughlin

Nature. 1991, 353, 674-677

]
.

Активация тромбоцитов тромбином

Тромбин является одним из основных активаторов тромбоцитов и главным ферментом системы свертывания крови. Тромбин действует на тромбоциты в первую очередь за счет связывания с PAR (Protease-Activated Receptors). На поверхности тромбоцитов имеется два вида ассоциированных с G-белками рецептора, PAR1 и PAR4 у человека, и PAR3 и PAR4 у мышей. Тромбин отрезает небольшой олигопептид от N-конца этих рецепторов, который и является лигандом соответствующего рецептора

, что приводит к моментальной активации тромбоцита. Для человека рецептор PAR1 считается основным, так как он обладает большей аффинностью к тромбину, чем PAR4 (50-200 пМ и 10-100 нМ, соответственно). PAR активируют Gq-ассоциированные GPCR
[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
и, возможно, G12/13
[
83
Primary haemostasis: newer insights

M. Berndt, P. Metharom, R. Andrews

Haemophilia. 2014, 20, 15-22

]
. Как описано выше, Gq-сигнализация приводит к повышению концентрации свободных ионов кальция в цитозоле клетки. При концентрациях тромбина даже порядка 0.1 нМ концентрация ионов кальция в тромбоцитах может моментально повысится десятикратно. Как мы показали ранее
[
23
Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

]
, пара схожих по сигнализации рецепторов нужна тромбоцитам для расширения диапазона чувствительности к тромбину (вместе PAR1 и PAR4 способны различать от 0.1 до 100 нМ тромбина), так и увеличения длительности кальциевого ответа при сохранении быстрого первоначального ответа.

Известно, что тромбин может снижать в тромбоцитах концентрацию cAMP, что обеспечивается как ингибированием аденилатциклазы (катализирует превращение ATP в cAMP) через Gi белок, связанный с рецептором тромбина, или косвенно, способствуя выбросу ADP, так и повышением активности фосфодиэстераз (ферменты, катализирующие гидролиз cAMP в AMP). Но, предполагается, что этот эффект носит опосредованный характер, обеспечивающийся секрецией ADP на P2Y12 рецептор

[
42
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

]
.

Кроме PAR-рецепторов тромбин способен связываться с GPIb-V-IX. Предполагается, что связывание с GPIb, облегчает взаимодействие ферментов с PAR-рецепторами, резко ускоряя их протеолиз, тем самым и ускоряя PAR-зависимую активацию тромбоцитов

[
84
New Fundamentals in Hemostasis

H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

]
.

Тромбин является одним из наиболее сильных активтаоров тромбоцитов и приводит к агрегации тромбоцитов, выбросу ADP и ATP, синтезу тромбоксана А2 (TxА2), а также, как и коллаген, способен приводить к самой сильной степени активации тромбоцита — прокоагулянтной активности. Данные пути сигнализации будут описаны далее.

АDP-индуцированная активация тромбоцитов

АDP содержится в плотных гранулах тромбоцита, которые начинают секретироваться при его активации

. Клетки сосудистого эндотелия, в случае их повреждении, тоже выбрасывают ADP, содержащийся в них. При добавлении ADP в систему in vitro, в тромбоцитах происходит активация фосфолипазы А2 (PLA2) и циклооксигеназы 1 (COX1), которые из арахидоновой кислоты производят TxA2
. Также в тромбоцитах запускается кальциевая сигнализация, изменяется их форма, происходит фосфорилирование их белков, и начинается процесс их агрегации
, причем агрегируют они тем сильнее, чем больше ADP было добавлено в систему
[
88
Defective platelet activation in Gαq-deficient mice

S. Offermanns, C. Toombs, Y. Hu, M. Simon

Nature. 1997, 389, 183-186

]
. Таким образом, в случае повреждения сосудистой стенки, некоторое количество тромбоцитов переходят в активированное состояние, и в крови появляется ADP, который может активировать другие тромбоциты.

На поверхности тромбоцитов имеется два типа рецепторов к ADP, P2Y1 и P2Y12, оба являются GPCR

. Тромбоцит, в неактивном состоянии, имеет около 160 рецепторов P2Y1 и 745 рецепторов P2Y12 на своей поверхности
. Причем, когда он активируется от воздействия сильного активатора (тромбина или коллагена), количество этих рецепторов на поверхности тромбоцита увеличивается, т.к. эти рецепторы содержатся в его α-гранулах, секретируемых тромбоцитом при его активации
.

Рецептор P2Y1 передает сигнал на Gq белок, что приводит к тем же ответам тромбоцита, что и при действии тромбина, однако гораздо менее выраженным

[
81
Domains specifying thrombin–receptor interaction

T. Vu, V. Wheaton, D. Hung, I. Charo, S. Coughlin

Nature. 1991, 353, 674-677

]
. Связывание ADP с рецептором P2Y12 приводит к активации Gi белка, что ведет к ингибированию аденилатциклазы и снижению уровня cAMP в клетке, как описано выше. При блокировании или удалении рецептора P2Y1, ADP по-прежнему способен ингибировать формирование cAMP, но сильно снижается его способность вызывать мобилизацию кальция, изменять форму тромбоцитов и их агрегацию. У P2Y1-/- мышей наблюдается незначительное увеличение продолжительности времени кровотечения, и возрастает устойчивость к тромбоэмболии, вызываемой введением ADP. Но у них не наблюдается предрасположенности к спонтанным кровотечениям
[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
. Тромбоциты P2Y12-/- мышей не способны нормально агрегировать в ответ на введение ADP. Они сохраняют способность изменять свою форму и активацию PLC, но это связано с нормальной работой P2Y1 рецептора. У таких тромбоцитов наблюдается снижение способности к ингибированию формирования cAMP в ответ на ADP
[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
.

Рассматривая ADP как активатор тромбоцитов, следует помнить, что в плазме ADP гидролизуется до AMP с периодом полураспада 10-15 минут, что влияет на количество тромбоцитов, которое он сможет активировать. Гидролиз ADP в плазме происходит под действием АДФазы, которая вырабатывается лимфоцитами и клетками эндотелия

. Также в гидролизе ADP принимают участие и эритроциты
[
91
The evolution of megakaryocytes to platelets

P. Nurden, C. Poujol, A. Nurden

Baillière's Clinical Haematology. 1997, 10, 1-27

]
. Этот процесс необходим для предотвращения появления в крови спонтанно активированных тромбоцитов.

Активация тромбоцитов TxA2, серотонином и адреналином.

TXA2 также относится к разряду слабых активаторов тромбоцитов, причем считается еще более слабым активатором, чем ADP. При добавлении TXA2 (или его стабильного аналога U46619) in vitro наблюдаются все функциональные ответы тромбоцитов, кроме прокоагулянтного

. TP-рецептор — единственный рецептор к TXA2 на поверхности тромбоцитов. Он ассоциирован с Gq и G12/13 белками, передача сигнала к ним от рецепторов и дальнейшие цепи химических превращений полностью идентичны описанным выше
[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
. Когда тромбоцит активируется от воздействия сильного активатора (тромбина или коллагена), количество этих рецепторов на поверхности тромбоцита увеличивается, т.к. эти рецепторы содержатся в его α-гранулах
.

У TP-/- мышей наблюдалось увеличение времени кровотечения. Их тромбоциты были неспособны агрегировать в ответ на введение TXA2, а также увеличивалось время их агрегации в ответ на коллаген. При добавлении аспирина (блокирует синтез TXA2) in vitro происходит ухудшение ответа тромбоцитов на ADP и коллаген. Дефект в ответе на тромбин выглядит как сдвиг кривой концентрация/агрегация, что указывает на то, что синтез TXA2 лишь поддерживает активацию тромбоцитов от тромбина, но он не является необходимым для этого процесса

[
18
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
.

Активация тромбоцита с помощью TxА2 не приводит к синтезу и выбросу TxА2

[
93
Detection of local ATP release from activated platelets using cell surface-attached firefly luciferase

R. Beigi, E. Kobatake, M. Aizawa, G. Dubyak

American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1999, 276, C267-C278

]
, но один тромбоцит выбрасывает около 10-8 нмоль ADP, содержащегося в плотных гранулах, причем характерное время их выброса равно примерно 5 секундам
. В присутствии тромбоцитов, TxА2 гидролизуется до тромбоксана В2 (период его полураспада около 30 секунд)
[
95
Signaling During Platelet Adhesion and Activation

Z. Li, M. Delaney, K. O'Brien, X. Du

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2010, 30, 2341-2349

]
, что сильно ограничивает область его распространения и количество тромбоцитов, которое он сможет активировать.

Сейчас сигнальный каскад, вызываемый активацией тромбоцита TxА2, известен далеко не полностью. Непонятно, почему при активации тромбоцита TxА2 не начинается синтез TXA2, хотя внутриклеточные события при этом полностью идентичны случаю активации от ADP. Возможно, короткоживущий TXA2 играет роль слабого инициатора процесса активации тромбоцитов, в то время как более долгоживущий ADP усиливает этот процесс и расширяет пространство активации тромбоцитов.

Значимую роль при активации тромбоцитов также могут играть адреналин и серотонин

. Серотонин содержится в тромбоцитарных плотных гранулах и секретируется при их активации. Показано также, что тромбоциты являются одним из основных хранилищ серотонина в кровотоке млекопитающих
[
97
Epinephrine restores platelet functions inhibited by ticagrelor: A mechanistic approach

A. Martin, D. Zlotnik, G. Bonete, E. Baron, B. Decouture, T. Belleville-Rolland, B. Le Bonniec, S. Poirault-Chassac, M. Alessi, P. Gaussem, A. Godier, C. Bachelot-Loza

European Journal of Pharmacology. 2020, 866, 172798

]
. Серотонин индуцирует активацию тромбоцитов Gq-зависимым образом, запуская кальциевые ответы через PLCb
[
98
Platelet ITAM signaling

W. Bergmeier, L. Stefanini

Current Opinion in Hematology. 2013, 20, 445-450

]
. Показано, что при терапии ингибиторами обратного захвата серотонина, применяемыми при депрессиях и ингибирующих переносчик SERT, у пациентов наблюдается нарушение агрегации тромбоцитов
[
97
Epinephrine restores platelet functions inhibited by ticagrelor: A mechanistic approach

A. Martin, D. Zlotnik, G. Bonete, E. Baron, B. Decouture, T. Belleville-Rolland, B. Le Bonniec, S. Poirault-Chassac, M. Alessi, P. Gaussem, A. Godier, C. Bachelot-Loza

European Journal of Pharmacology. 2020, 866, 172798

]
. Агонистом адреналина на тромбоцитах является a2-адренорецептор, который, индуцирует схожую сигнализацию с рецептором P2Y12: a2 через Gi ингибирует активность аденилат-циклазы, что потенциирует активацию тромбоцитов
.

Рецепторы, вызывающие активацию тирозинкиназ

Второй важной ветвью сигнализации в тромбоцитах является тирозинкиназная сигнализация. Тирозинкиназная сигнализация в тромбоцитах построена вокруг каскада тирозинкиназ, которые фосфорилируют как друг друга, так и окружающие их белки эффекторы

. Каждая из этих тирозинкиназ обладает сложной доменной структурой, которая определяет механизмы их активации и регуляции
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. При этом не менее важную роль играют и ферменты, проводящие обратные реакции реакциям фосфорилирования – тирозин-фосфатазы, которые управляют как активационными, так и ингибиторными сигналами
[
102,
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. Несмотря на большое разнообразие тирозинкиназ большинство регуляторных доменов, отвечающих за их регуляцию, схожи по общим принципам их действия
. Среди регуляторных доменов тирозинкиназ встречаются: кальций связывающие домены (С2-домен, EF-«ручки»); домены, узнающие определённые аминокислотные последовательности (SH2, SH3, иммуноглобулин-подобные домены, DED); мембрана-связывающие домены (PH, SH4, C1); актин-связывающие домены (REM; FH2)
[
104
SH2 domains: modulators of nonreceptor tyrosine kinase activity

P. Filippakopoulos, S. Müller, S. Knapp

Current Opinion in Structural Biology. 2009, 19, 643-649

]
.

Kлючевыми киназами, необходимыми для инициации тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах, являются тирозинкиназы семейства SFK, а также киназы Syk и Btk. Тирозинкиназы семейства SFK, к которому в тромбоцитах относятся Src, Fyn и Lyn

[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
, представляют собой градуированные «включатели»: активация их доменов ведёт к усилению их активности. Данные киназы состоят из 4х основных доменов: каталитического домена, проводящего фосфорилирование, а также трех регуляторных SH2, SH3, SH4
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. SH2-домен SFK киназ позволяет им связываться с фосфорилированными остатками тирозина на других белках, например, в фосфорилированных последовательностях YxxL, которые называют иммунными тирозин-активируемыми мотивами (ITAM)
. SH3 домен необходим SFK для связывания с полипролиновыми регионами (xPPxP) в белках
[
106
Molecular priming of Lyn by GPVI enables an immune receptor to adopt a hemostatic role

A. Schmaier, Z. Zou, A. Kazlauskas, L. Emert-Sedlak, K. Fong, K. Neeves, S. Maloney, S. Diamond, S. Kunapuli, J. Ware, L. Brass, T. Smithgall, K. Saksela, M. Kahn

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009, 106, 21167-21172

]
: например, благодаря доменам SH3 SFK киназы могут ассоциироваться с BCR и GPVI рецепторами, в цитоплазматических доменах которых присутствуют обогащённые полипролином последовательности
[
107
Molecular Mechanism of the Syk Activation Switch

E. Tsang, A. Giannetti, D. Shaw, M. Dinh, J. Tse, S. Gandhi, H. Ho, S. Wang, E. Papp, J. Bradshaw

Journal of Biological Chemistry. 2008, 283, 32650-32659

]
. Наконец, SH4-домен SFK киназ необходим для их локализации в примембранных регионах: к данному региону присоединяются остатки пальмитоиловой или меристоиловой кислот, которые являются гидрофобными и, потому, позволяют SFK оказаться «заякоренной» в мембране
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. Сама по себе активация SFK обыкновенно протекает по следующей схеме: изначально SFK находятся в аутоингибированном состоянии, затем фосфатаза CD148 проводит их дефосфорилирование, что переводит их в ¼ активное состояние
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. Затем, SFK могут присоединиться освободившимися SH3 и SH2 доменами к белкам мишеням (например, к рецепторам), что переведёт их в ¾ активное состояние. После этого, развёрнутые SFK могут перейти в максимально активное состояние путём аутофосфорилирования
. Интересно, что реакцию, обратную реакции максимальной активации проводит та же фосфатаза CD148, что и изначальную
.

Тирозинкиназы Syk являются переключателями типа «ИЛИ» - они могут быть активированы путём активации одного или другого доменов. Структура Syk киназ является менее сложной, чем структура SFK киназ: Syk состоят из трех доменов: одного каталитического и двух SH2-доменов

, при этом к активации Syk приводит одновременное связывание двух их SH2-доменов с фосфорилированными остатками тирозина в последовательностях YxxL
, либо Syk могут быть активированы путём фосфорилирования их линкерного домена между киназным и первым из SH2-доменов
. Данная реакция может быть проведена как представителями SFK, так и активными Syk
[
109
Dynamics of the Tec-family tyrosine kinase SH3 domains

J. Roberts, S. Tarafdar, R. Joseph, A. Andreotti, T. Smithgall, J. Engen, T. Wales

Protein Science. 2016, 25, 852-864

]
.

Тирозинкиназы Btk и Tec

являются переключателями типа «И» - для их активации необходимо выполнение сразу нескольких условий
. Тирозинкиназы Btk состоят из PH, SH3, SH2 и киназного доменов
. При наработке PIP3 Btk локализуются на плазматической мембране и их SH2 домен связывается с фосфотирозином
[
42,
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

46
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

]
, а SH3, как предполагается
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
, может быть необходим для притягивания других белков, содержащих полипролин
[
110
Ibrutinib-associated bleeding: pathogenesis, management and risk reduction strategies

J. Shatzel, S. Olson, D. Tao, O. McCarty, A. Danilov, T. DeLoughery

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2017, 15, 835-847

]
. Все эти события приводят к активации Btk, которые, в свою очередь, приводят к активации PLCγ2, также локализованных в данной области благодаря своим SH2 доменам и дополнительным адаптерам vav и SLP-76
[
46,
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

]
. В настоящее время в клинике используется сразу несколько фармакологических ингибиторов Btk киназ, которые применяются при терапии лейкозов
.

Активация тирозинкиназ является первым шагом при инициации сборки сигналосом – крупных белковых комплексов - источников распространения внутриклеточного сигнала

[
112
Dual-Specificity Phosphatase 3 Deficiency or Inhibition Limits Platelet Activation and Arterial Thrombosis

L. Musumeci, M. Kuijpers, K. Gilio, A. Hego, E. Théâtre, L. Maurissen, M. Vandereyken, C. Diogo, C. Lecut, W. Guilmain, E. Bobkova, J. Eble, R. Dahl, P. Drion, J. Rascon, Y. Mostofi, H. Yuan, E. Sergienko, T. Chung, M. Thiry, Y. Senis, M. Moutschen, T. Mustelin, P. Lancellotti, J. Heemskerk, L. Tautz, C. Oury, S. Rahmouni

Circulation. 2015, 131, 656-668

]
. При тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах в основе сигналосом находится адаптерный белок LAT, который обладает большим количеством сайтов фосфорилирования
[
30
Control of Platelet CLEC-2-Mediated Activation by Receptor Clustering and Tyrosine Kinase Signaling

A. Martyanov, F. Balabin, J. Dunster, M. Panteleev, J. Gibbins, A. Sveshnikova

Biophysical Journal. 2020, 118, 2641-2655

]
. К фосфо-LAT присоединяются PI3K типа I, в регуляторной (p85) субъединице которых находятся два SH2-домена, связывание которых с PY ведёт к разворачиванию и активации каталитической субъединицы p110, которая, в свою очередь, проводит фосфорилирование мембранного фосфоинозитида PIP2, нарабатывая PIP3 ­
[
46
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

]
. PIP3 является субстратом для PH-домена, определяющего посадку на плазматическую мембрану целого ряда компонентов тирозинкиназной сигнальной сети тромбоцита, в том числе Btk и PLC типа γ2
[
42,
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

]
.

Важно заметить, что при активации тирозинкиназной сигнализации важную роль играют не только киназы, но и фосфатазы. Так, помимо вышеупомянутой CD148, регуляцию SFK могут также осуществлять PTP1B и DUSP3 фосфатазы, которые активируются в процессе распространения активационного сигнала путём фосфорилирования

. При этом PTP1B является ассоциированной с мембраной эндоплазматического ретикулума и начинает играть роль при изменении формы тромбоцита, когда происходит распластывание и внутриклеточные органеллы оказываются в непосредственной близости к плазматической мембране
. С другой стороны, также важную роль играют и негативные регуляторы активации, в частности, фосфатазы SHP-1,2. SHP-1,2 обладают двумя SH2 доменами, которые ассоциируются с фосфорилированными тирозинами в иммунных тирозиновых ингибиторных мотивах (ITIM). Активированные SHP проводят дефосфорилирование ITAM
[
114
Functional significance of the platelet immune receptors GPVI and CLEC-2

J. Rayes, S. Watson, B. Nieswandt

Journal of Clinical Investigation. 2019, 129, 12-23

]
. Фосфорилирование ITIM также приводит и к активации SHIP1,2, которые проводят реакцию, обратную реакции, катализируемой PI3K – дефосфорилируют PIP3, ингибируя таким образом активацию Btk
[
48
SH2-containing inositol 5-phosphatases 1 and 2 in blood platelets: their interactions and roles in the control of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate levels

S. GIURIATO, X. PESESSE, S. BODIN, T. SASAKI, C. VIALA, E. MARION, J. PENNINGER, S. SCHURMANS, C. ERNEUX, B. PAYRASTRE

Biochemical Journal. 2003, 376, 199-207

]
.

Рецепторы, запускающие или подавляющие тирозинкиназную сигнализацию

На человеческих тромбоцитах присутствует 3 типа рецепторов, запускающих активацию каскада тирозинкиназ: рецептор к коллагену GPVI, рецептор к подопланину CLEC-2, а также рецептор к иммуноглобулинам класса G FcγRIIa

. Каждый из данных рецепторов запускает схожий сигнальный каскад, однако особенности их внутриклеточного строения определяют характерные времена и степень силы активации тромбоцитов при стимуляции через них. Каждый из данных рецепторов несёт в своём цитоплазматическом домене одну (CLEC-2)
[
115
GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

]
или несколько (FcgRIIa) последовательностей YxxL
– ITAM и hemITAM, соответственно. YxxL последовательности также могут быть на ассоциированных с рецепторами белках – так, цитоплазматический домен GPVI ковалентно связан с FcR-цепью, несущей на себе ITAM
[
116
Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

M. Arman, K. Krauel

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

]
. Важно заметить, что тирозинкиназная ветвь сигнализации в тромбоцитах людей и мышей значительно отличается: так, на тромбоцитах мышей отсутствует FcgRIIa
. Тирозинкиназная сигнализация в тромбоцитах также может вызываться рецепторными тирозинкиназами EphA4 и EphB1, активируемыми эфрином. Показано, что их активация ведёт к адгезии и агрегации тромбоцитов к фибриногену. При этом основным элементов сигнального каскада данных рецепторов является PI3K
[
118
SLAM Family Receptors and SAP Adaptors in Immunity

J. Cannons, S. Tangye, P. Schwartzberg

Annual Review of Immunology. 2011, 29, 665-705

]
.

Помимо активирующих тирозинкиназа-зависимых рецепторов на поверхности тромбоцитов также присутствуют и ингибирующие тирозинкиназные рецепторы, несущие в своих цитоплазматических доменах последовательности ITIM и ITSM

. Наиболее изученными среди них являются рецепторы PECAM-1 (CD31) и G6b
[
114
Functional significance of the platelet immune receptors GPVI and CLEC-2

J. Rayes, S. Watson, B. Nieswandt

Journal of Clinical Investigation. 2019, 129, 12-23

]
. Считается, что данные рецепторы необходимы для ограничения активации тромбоцита: так, тромбоцит, который взаимодействовал с тромбом, но не закрепился в нём, может вернуться в покоящееся состояние во многом за счёт активности PECAM-1 и G6b-B
[
114
Functional significance of the platelet immune receptors GPVI and CLEC-2

J. Rayes, S. Watson, B. Nieswandt

Journal of Clinical Investigation. 2019, 129, 12-23

]
. Однако механизмы, по которым данные рецепторы ограничивают активацию, разнятся.

PECAM-1 присутствует не только на тромбоцитах, но и на лейкоцитах, а также эндотелиоцитах

[
120
Minimal regulation of platelet activity by PECAM-1

T. Dhanjal, E. Ross, J. Auger, O. Mccarty, C. Hughes, Y. Senis, S. Watson

Platelets. 2007, 18, 56-67

]
. Показано, что тромбоцитарный PECAM-1 участвует во взаимодействии тромбоцитов и эндотелиоцитов, выступая в качестве адгезионной молекулы
[
120
Minimal regulation of platelet activity by PECAM-1

T. Dhanjal, E. Ross, J. Auger, O. Mccarty, C. Hughes, Y. Senis, S. Watson

Platelets. 2007, 18, 56-67

]
. В покоящихся тромбоцитах ITSM в его цитоплазматическом домене скрыт, однако при активации тромбоцита остаток серина в примембранном регионе PECAM-1 фосфорилируется
[
121
Collagen, Convulxin, and Thrombin Stimulate Aggregation-independent Tyrosine Phosphorylation of CD31 in Platelets

M. Cicmil, J. Thomas, T. Sage, F. Barry, M. Leduc, C. Bon, J. Gibbins

Journal of Biological Chemistry. 2000, 275, 27339-27347

]
. Это приводит к разворачиванию цитоплазматического домена PECAM-1 и высвобождению ITIM и ITSM, которые затем могут быть фосфорилированы SFK
. In vitro было продемонстрировано, что ITIM и ITSM фосфорилируются при стимуляции тромбоцитов тромбином или коллагеном
. К ITIM-ITSM мотивам PECAM-1 присоединяются SHP-1 или SHP-2 фосфатазы, которые несут на себе по два SH-2 мотива. Это приводит к их активации: активные SHP-1, SHP-2 дефосфорилируют ITAM мотивы, Syk киназы, SFK киназы и LAT адаптеры
[
123
Differential association of cytoplasmic signalling molecules SHP-1, SHP-2, SHIP and phospholipase C-γ1 with PECAM-1/CD31

N. Pumphrey, V. Taylor, S. Freeman, M. Douglas, P. Bradfield, S. Young, J. Lord, M. Wakelam, I. Bird, M. Salmon, C. Buckley

FEBS Letters. 1999, 450, 77-83

]
. Показано, что SHIP-1 и SHIP-2 также могут присоединяться к PECAM-1
[
124
Maintenance of murine platelet homeostasis by the kinase Csk and phosphatase CD148

J. Mori, Z. Nagy, G. Di Nunzio, C. Smith, M. Geer, R. Al Ghaithi, J. van Geffen, S. Heising, L. Boothman, B. Tullemans, J. Correia, L. Tee, M. Kuijpers, P. Harrison, J. Heemskerk, G. Jarvis, A. Tarakhovsky, A. Weiss, A. Mazharian, Y. Senis

Blood. 2018, 131, 1122-1144

]
, однако нет достоверных данных, что они активно участвуют в распространении ингибиторного сигнала.

Цитоплазматический домен G6b-B также состоит из двух мотивов ITAM-ISTM, однако, в отличие от PECAM-1, G6b-B находится в постоянном доступе для фосфорилирования SFK-киназами

. Таким образом, G6b-B фосфорилирован не только в активированных клетках, но и в покоящихся, что приводит к поддержанию в постоянно активном состоянии доли SHP-1 и SHP-2 фосфатаз
. Также существуют гипотезы, по которым фосфорилирование G6b-B может быть усилено путём его связывания с гепарансульфатом. Таким образом, в отличие от PECAM-1, который является, в основном, ограничивающим активацию рецептором, G6b-B представляет собой скорее активационный порог, который не позволяет тромбоцитам перейти в активированное состояние при слишком слабых сигналах
[
126
Fibrin and D-dimer bind to monomeric GPVI

M. Onselaer, A. Hardy, C. Wilson, X. Sanchez, A. Babar, J. Miller, C. Watson, S. Watson, A. Bonna, H. Philippou, A. Herr, D. Mezzano, R. Ariëns, S. Watson

Blood Advances. 2017, 1, 1495-1504

]
.

GPVI – ключевой тромбоцитарный рецептор к коллагену

GPVI – мембранный гликопротеин, узнающий несколько последовательностей глицин-пролин-гидроксипролин (GPO), характерных для коллагена

[
116
Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

M. Arman, K. Krauel

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

]
. Также активно обсуждается роль GPVI в активации тромбоцитов фибрином
[
127
Pharmacological Blockade of Glycoprotein VI Promotes Thrombus Disaggregation in the Absence of Thrombin

M. Ahmed, V. Kaneva, S. Loyau, D. Nechipurenko, N. Receveur, M. Le Bris, E. Janus-Bell, M. Didelot, A. Rauch, S. Susen, N. Chakfé, F. Lanza, E. Gardiner, R. Andrews, M. Panteleev, C. Gachet, M. Jandrot-Perrus, P. Mangin

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2020, 40, 2127-2142

]
, фибриногеном
и роли GPVI в поддержании «outside-in» активации кластеризованных фибриногеном интегринов
[
129
Comparison of the GPVI inhibitors losartan and honokiol

M. Onselaer, M. Nagy, C. Pallini, J. Pike, G. Perrella, L. Quintanilla, J. Eble, N. Poulter, J. Heemskerk, S. Watson

Platelets. 2020, 31, 187-197

]
. Для инициации сигнализации GPVI требуется кластеризация
[
116,
Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

M. Arman, K. Krauel

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

130
Clustering of glycoprotein VI (GPVI) dimers upon adhesion to collagen as a mechanism to regulate GPVI signaling in platelets

N. Poulter, A. Pollitt, D. Owen, E. Gardiner, R. Andrews, H. Shimizu, D. Ishikawa, D. Bihan, R. Farndale, M. Moroi, S. Watson, S. Jung

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2017, 15, 549-564

]
, механизм которой не уточнён до конца
[
131
Function of Platelet Glycosphingolipid Microdomains/Lipid Rafts

K. Komatsuya, K. Kaneko, K. Kasahara

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 5539

]
. Важную роль при кластеризации тромбоцитарных GPVI играют липидные рафты – обогащённые холестеролом и сфингомиелином мембранные регионы, в которых значительно замедлена диффузия
. С липидными рафтами ассоциировано большое количество сигнальных молекул, в частности, LAT, а также SFK киназы
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
.

Цитоплазматический домен GPVI через солевые мостики ассоциирован с FcγR-цепью, на которой присутствует ITAM

. Через SH3 домены с GPVI ассоциированы SFK-киназы, поддерживаемые в активном состоянии CD148 фосфатазами
[
102
Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

]
. При активации и кластеризации GPVI SFK фосфорилируют ITAM’ы оказывающихся рядом комплексов GPVI-FcgR
[
46,
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

116
Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

M. Arman, K. Krauel

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

]
. К фосфорилированным ITAM присоединяются Syk киназы, становясь при этом активными
. Благодаря способности Syk к аутофосфорилированию возникает положительная обратная связь, ускоряющая активацию Syk в цитозоле (Рис. 3). Активные Syk фосфорилируют LAT, к которым своими доменами SH-2 присоединяются vav1/3, SLP-76, PLCg2 и PI3K, формируя сигналосому
[
46
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

]
. Активировавшиеся при этом PI3K фосфорилируют PIP2, производя PIP3 и привлекая таким образом Btk
. Оказавшиеся в сигналосоме Btk активируются и запускают активацию PLCg2, которая гидролизует PIP2 до DAG и IP3. IP3 далее запускает кальциевую сигнализацию в тромбоците
[
115
GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

]
.

CLEC-2 – рецептор, необходимый для предотвращения смешения крови и лимфы

Клетки лимфатического эндотелия выставляют на свою поверхности подопланин – гликопротеин, способный активировать тромбоциты через их рецептор CLEC-2

[
115
GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

]
. Также CLEC-2 вместе с GPVI оказывается важным при предотвращении воспалительных кровотечений и поддержании целостности сосудов
[
134
Syk and Src Family Kinases Regulate C-type Lectin Receptor 2 (CLEC-2)-mediated Clustering of Podoplanin and Platelet Adhesion to Lymphatic Endothelial Cells

A. Pollitt, N. Poulter, E. Gitz, L. Navarro-Nuñez, Y. Wang, C. Hughes, S. Thomas, B. Nieswandt, M. Douglas, D. Owen, D. Jackson, M. Dustin, S. Watson

Journal of Biological Chemistry. 2014, 289, 35695-35710

]
.

Внутриклеточный сигнальный каскад рецептора CLEC-2, за исключением начальных стадий активации, схож со внутриклеточным каскадом активации GPVI

[
109,
Dynamics of the Tec-family tyrosine kinase SH3 domains

J. Roberts, S. Tarafdar, R. Joseph, A. Andreotti, T. Smithgall, J. Engen, T. Wales

Protein Science. 2016, 25, 852-864

116
Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

M. Arman, K. Krauel

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

]
. В отличие от GPVI, в цитоплазматическом домене CLEC-2 присутствует только одна аминокислотная последовательность YxxL, а также отсутствует полипролин-обогащённый регион
[
109,
Dynamics of the Tec-family tyrosine kinase SH3 domains

J. Roberts, S. Tarafdar, R. Joseph, A. Andreotti, T. Smithgall, J. Engen, T. Wales

Protein Science. 2016, 25, 852-864

]
. Таким образом, активация CLEC-2 в ещё большей степени зависит от кластеризации рецепторов, а также от локализации CLEC-2 в области, богатой другими сигнальными молекулами
. Первичное фосфорилирование CLEC-2 при его активации производится Syk киназами, которые в незначительном количестве поддерживаются в активном состоянии в покоящихся тромбоцитах за счёт активности SFK
[
109
Dynamics of the Tec-family tyrosine kinase SH3 domains

J. Roberts, S. Tarafdar, R. Joseph, A. Andreotti, T. Smithgall, J. Engen, T. Wales

Protein Science. 2016, 25, 852-864

]
. Затем к фосфорилированным и кластеризованным CLEC-2 присоединяются неактивные Syk, что делает их активными и запускает цепь положительной обратной связи (Рис. 3). Наработка активных Syk, аналогично GPVI, приводит к формированию LAT-сигналосомы и активации PLCγ2, инициирующей кальциевую сигнализацию в тромбоцитах.

Схема тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах на примере сигнала, индуцируемого рецептором CLEC-2. После связывания рецептора с лигандом (подопланином, родоцитином или фукоиданом) происхоодит его кластеризация. При этом, считается, что рецепторы кластеризуются в области липидных рафтов (мембранных микродоменов, обогащённых холестерином). GPVI и FcRIIA также кластеризуются после связывания с лигандами. В покоящихся тромбоцитах незначительные количества SFK поддерживаются в активном состоянии фосфатазами CD148. Активные SFK также могут поддерживать небольшие количества активных Syk. При кластеризации рецепторов, запускающих активацию тирозинкиназ, либо Syk (CLEC-2), либо SFK (GPVI, FcRIIA) фосфорилируют их цитоплазменные домены, что приводит к усилению активации Syk. Активные Syk фосфорилируют адаптерный белок LAT, к которому присоединяются PI3K, становясь активными. PI3K проводят фосфорилирование PIP2, производя PIP3, который выступает в роли докингового сайта для тирозинкиназы Btk. Btk при посадке на мембрану становится активной и фосфорилирует PLC2, также присоединившуюся к фосфорилированному LAT. Активные PLC2 гидролизуют PIP2, производя вторичный мессенджер активации IP3, который активирует рецептор IP3R на эндоплазматическом ретикулуме. IP3R выпускает ионы кальция из внутриклеточных хранилищ тромбоцита, которые возвращаются туда из-за активности насосов SERCA. Ионы кальция также могут ингибировать IP3R. Это приводит к инициации кальциевых осцилляций в цитозоле тромбоцитов.
Figure 3. Схема тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах на примере сигнала, индуцируемого рецептором CLEC-2. После связывания рецептора с лигандом (подопланином, родоцитином или фукоиданом) происхоодит его кластеризация. При этом, считается, что рецепторы кластеризуются в области липидных рафтов (мембранных микродоменов, обогащённых холестерином). GPVI и FcRIIA также кластеризуются после связывания с лигандами. В покоящихся тромбоцитах незначительные количества SFK поддерживаются в активном состоянии фосфатазами CD148. Активные SFK также могут поддерживать небольшие количества активных Syk. При кластеризации рецепторов, запускающих активацию тирозинкиназ, либо Syk (CLEC-2), либо SFK (GPVI, FcRIIA) фосфорилируют их цитоплазменные домены, что приводит к усилению активации Syk. Активные Syk фосфорилируют адаптерный белок LAT, к которому присоединяются PI3K, становясь активными. PI3K проводят фосфорилирование PIP2, производя PIP3, который выступает в роли докингового сайта для тирозинкиназы Btk. Btk при посадке на мембрану становится активной и фосфорилирует PLC2, также присоединившуюся к фосфорилированному LAT. Активные PLC2 гидролизуют PIP2, производя вторичный мессенджер активации IP3, который активирует рецептор IP3R на эндоплазматическом ретикулуме. IP3R выпускает ионы кальция из внутриклеточных хранилищ тромбоцита, которые возвращаются туда из-за активности насосов SERCA. Ионы кальция также могут ингибировать IP3R. Это приводит к инициации кальциевых осцилляций в цитозоле тромбоцитов.

Адгезионные и иммунные рецепторы

Одним из первых ответов тромбоцитов на возникающее повреждение стенок кровеносных сосудов является их адгезия в области повреждения, ключевыми рецепторами для которой являются гликопротеин Ib и интегрины aIIbb3. Гликопротеин Ib и интегрины aIIbb3 не вызывают активацию тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах напрямую: ни на GPIb, ни на aIIbb3 нет фосфорилируемых остатков тирозина, которые могли бы послужить активационными сайтами для инициации тирозинкиназной сигнализации

[
18,
Platelet signaling

Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, None, 59-85

]
. Однако, опосредованно, путём формирования комплексов с другими ферментами и друг с другом, и GPIb, и aIIbb3 могут оказывать существенный вклад в активацию тромбоцитов, инициируя активацию тирозинкиназ
[
129,
Comparison of the GPVI inhibitors losartan and honokiol

M. Onselaer, M. Nagy, C. Pallini, J. Pike, G. Perrella, L. Quintanilla, J. Eble, N. Poulter, J. Heemskerk, S. Watson

Platelets. 2020, 31, 187-197

136
Targeting Integrin and Integrin Signaling in Treating Thrombosis

B. Estevez, B. Shen, X. Du

Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2015, 35, 24-29

]
. Другими важными интегринами на поверхности тромбоцитов являются интегрины αvβ3, αvβ1, α6β1, необходимые как взаимодействия тромбоцитов с фибронектином и ламинином, а также для образования тромбоцитарных агрегатов с иммунными клетками
.

GPIb является комплексом из трех гликопротеинов (GPIb-GPIX-GPV), который связывается с А2 доменом развёрнутого в потоке vWF

[
138,
A short history of platelet glycoprotein Ib complex

Clemetson K

Thrombosis and Haemostasis. 2007, 98 (1), 63-8

139
Association of a phospholipase A2 (14-3-3 protein) with the platelet glycoprotein Ib-IX complex

X. Du, S. Harris, T. Tetaz, M. Ginsberg, M. Berndt

Journal of Biological Chemistry. 1994, 269, 18287-18290

]
. Это приводит к притягиванию тромбоцитов к активирующим поверхностям – повреждённому эндотелию или коллагену субэндотелиального матрикса – и инициации активации, адгезии и агрегации
. Было показано, что GPIb является механочувствительным рецептором, однако последовательность внутриклеточных событий, происходящих в тромбоците при связывании GPIb с лигандом, неясна. GPIb образует комплекс с адаптерным белком 14-3-3x, обладающим также фосфолипазной активностью
[
140
The structure of the GPIb–filamin A complex

F. Nakamura, R. Pudas, O. Heikkinen, P. Permi, I. Kilpeläinen, A. Munday, J. Hartwig, T. Stossel, J. Ylänne

Blood. 2006, 107, 1925-1932

]
, а также с филамином
. Данные белки связывают GPIb с актиновым цитоскелетом и могут определять его механочувствительность. С другой стороны, взаимосвязь GPIb и 14-3-3x может быть важна и при активации связанной с GPIb PI3K киназы
[
143
Platelet integrin αIIbβ3: signal transduction, regulation, and its therapeutic targeting

J. Huang, X. Li, X. Shi, M. Zhu, J. Wang, S. Huang, X. Huang, H. Wang, L. Li, H. Deng, Y. Zhou, J. Mao, Z. Long, Z. Ma, W. Ye, J. Pan, X. Xi, J. Jin

Journal of Hematology & Oncology. 2019, 12, None

]
. Предполагается, что при активации GPIb происходит активация PI3K, которая, производя PIP3, оказывает вклад в активацию тирозинкиназы Btk
[
46,
Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

143
Platelet integrin αIIbβ3: signal transduction, regulation, and its therapeutic targeting

J. Huang, X. Li, X. Shi, M. Zhu, J. Wang, S. Huang, X. Huang, H. Wang, L. Li, H. Deng, Y. Zhou, J. Mao, Z. Long, Z. Ma, W. Ye, J. Pan, X. Xi, J. Jin

Journal of Hematology & Oncology. 2019, 12, None

]
.

«Outside-in» сигнализация от интегринов инициируется при их кластеризации

[
42,
Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

Nature. 2002, 420, 85-89

144
The platelet Fc receptor, FcγRIIa

J. Qiao, M. Al-Tamimi, R. Baker, R. Andrews, E. Gardiner

Immunological Reviews. 2015, 268, 241-252

]
. Аналогично GPIb, детальная последовательность сигнальных событий при этом процессе в настоящий момент неизвестна. Показано, что для инициации «outside-in» активации необходимо участие FcγR-цепей рецептора GPVI, а также FcγRIIa рецептора
[
129,
Comparison of the GPVI inhibitors losartan and honokiol

M. Onselaer, M. Nagy, C. Pallini, J. Pike, G. Perrella, L. Quintanilla, J. Eble, N. Poulter, J. Heemskerk, S. Watson

Platelets. 2020, 31, 187-197

144
The platelet Fc receptor, FcγRIIa

J. Qiao, M. Al-Tamimi, R. Baker, R. Andrews, E. Gardiner

Immunological Reviews. 2015, 268, 241-252

]
. С другой стороны, было предположено, что в цитоплазматическом домене aIIbb3 интегрина также присутствует несколько остатков тирозина, которые не относятся ни к каким каноничным мотивам, однако могут быть фосфорилированы
[
129
Comparison of the GPVI inhibitors losartan and honokiol

M. Onselaer, M. Nagy, C. Pallini, J. Pike, G. Perrella, L. Quintanilla, J. Eble, N. Poulter, J. Heemskerk, S. Watson

Platelets. 2020, 31, 187-197

]
. Влияют ли они на активацию в настоящий момент неизвестно. Мы предполагаем, что наиболее вероятным является следующая цепочка событий: тромбоциты получают «механический» сигнал от GPIb за счёт взаимодействия с vWF, который привлекает их к коллагену. Затем тромбоциты получают последующий сигнал от рецептора GPVI при их контакте с коллагеном
. Это приводит к инициации тирозинкиназной сигнализации. Активированные GPIb также приводят к активации ассоциированной с ними PI3K, которая усиливает активацию тирозинкиназ
[
143
Platelet integrin αIIbβ3: signal transduction, regulation, and its therapeutic targeting

J. Huang, X. Li, X. Shi, M. Zhu, J. Wang, S. Huang, X. Huang, H. Wang, L. Li, H. Deng, Y. Zhou, J. Mao, Z. Long, Z. Ma, W. Ye, J. Pan, X. Xi, J. Jin

Journal of Hematology & Oncology. 2019, 12, None

]
. Данные сигналы совместно запускают активацию интегринов «inside-out», а затем и «outside-in», происходящий тирозинкиназо-зависимо
. Таким образом, GPIb и αIIbβ3 индуцированная сигнализация становятся сильными положительными обратными связями для тирозинкиназной сигнализации в тромбоцитах.

Показано, что при бактериальном сепсисе и генерации иммунного ответа тромбоциты могут окружать появившиеся в кровотоке бактерии, что будет приводить к гибели бактерий

[
145
Platelet Toll-like receptor expression and activation induced by lipopolysaccharide and sepsis

T. Claushuis, A. Van Der Veen, J. Horn, M. Schultz, R. Houtkooper, C. Van ’T Veer, T. Van Der Poll

Platelets. 2019, 30, 296-304

]
. Из тирозинкиназных рецепторов тромбоцитов к иммунным относится рецептор к иммуноглобулинам класса G (IgG) - FcγRIIa
[
115
GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

]
. Прямой функцией данного рецептора является узнавание постоянной аминокислотной последовательности IgG, опсонизирующих антигены. Принципиально, что одиночные IgG не способны к активации тромбоцитов через FcγRIIa
[
115,
GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

145
Platelet Toll-like receptor expression and activation induced by lipopolysaccharide and sepsis

T. Claushuis, A. Van Der Veen, J. Horn, M. Schultz, R. Houtkooper, C. Van ’T Veer, T. Van Der Poll

Platelets. 2019, 30, 296-304

]
. Таким образом, как и GPVI с CLEC-2, FcγRIIa требует кластеризации для нормальной активации через него тромбоцита.

Среди рецепторов, вызывающих активацию тромбоцитов, отдельно выделяется группа рецепторов, узнающих патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) и молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждениями (DAMP) – Toll-подобные рецепторы (TLR)

[
146,
Platelet Toll-Like Receptors Mediate Thromboinflammatory Responses in Patients With Essential Thrombocythemia

C. Marín Oyarzún, A. Glembotsky, N. Goette, P. Lev, G. De Luca, M. Baroni Pietto, B. Moiraghi, M. Castro Ríos, A. Vicente, R. Marta, M. Schattner, P. Heller

Frontiers in Immunology. 2020, 11, None

]
. Основным эффектором TLR-рецепторов в ядерных клетках является фактор транскрипции NFkB, который запускает транскрипцию генов и de novo синтез белков в ответ на активацию, что не применимо к тромбоцитам
[
148
Моделирование секреции гранул при активации тромбоцитов через TLR4-рецептор

Майоров А.С., Шепелюк Т.О., Балабин Ф.А., Мартьянов А.А., Нечипуренко Д.Ю., Свешникова А.Н.

Биофизика. 2018, 63 (3), 475-483

]
.

Активация TLR рецепторов инициирует сборку сигнального комплекса, в основании которого находится адаптерный белок MyD88 – миддосомы

. Миддосома также состоит из адаптера TIRAP, который приводит к активации IKkb, а также фактора транскрипции NFᴂB
[
146,
Platelet Toll-Like Receptors Mediate Thromboinflammatory Responses in Patients With Essential Thrombocythemia

C. Marín Oyarzún, A. Glembotsky, N. Goette, P. Lev, G. De Luca, M. Baroni Pietto, B. Moiraghi, M. Castro Ríos, A. Vicente, R. Marta, M. Schattner, P. Heller

Frontiers in Immunology. 2020, 11, None

148
Моделирование секреции гранул при активации тромбоцитов через TLR4-рецептор

Майоров А.С., Шепелюк Т.О., Балабин Ф.А., Мартьянов А.А., Нечипуренко Д.Ю., Свешникова А.Н.

Биофизика. 2018, 63 (3), 475-483

]
. С другой стороны, формирование комплекса миддосомы также приводит к активации растворимой гуанилат-циклазы, запускающей наработку cGMP, а также активацию протеинкиназы G и дальнейшую ингибиторную сигнализацию
[
148
Моделирование секреции гранул при активации тромбоцитов через TLR4-рецептор

Майоров А.С., Шепелюк Т.О., Балабин Ф.А., Мартьянов А.А., Нечипуренко Д.Ю., Свешникова А.Н.

Биофизика. 2018, 63 (3), 475-483

]
. Наконец, в комплекс миддосомы также входят адаптеры IRAK1, IRAK4 и TRAF6. К TRAF-6 в комплексе миддосомы присоединяется PI3K, что приводит к активации Akt и eNOS, которая синтезирует NO, также приводящий к активации гуанилат-циклазы, наработке cGMP и активации PKG
[
150
IκB kinase phosphorylation of SNAP-23 controls platelet secretion

Z. Karim, J. Zhang, M. Banerjee, M. Chicka, R. Al Hawas, T. Hamilton, P. Roche, S. Whiteheart

Blood. 2013, 121, 4567-4574

]
. Показано, что активация IKkb приводит к активации SNAP23 – одного из ключевых белков, необходимых для дегрануляции тромбоцита
. Таким образом, TLR-индуцированная сигнализация, потенциально, может приводить как к активации тромбоцитов, так и к ингибированию тромбоцитов. Из семейства TLR, экспрессия рецепторов TLR2 на тромбоцитах была однозначно продемонстрирована как по мРНК, так и на белковом уровне
[
152
Efficient phagocytosis of periodontopathogens by neutrophils requires plasma factors, platelets and TLR2

A. ASSINGER, M. LAKY, G. SCHABBAUER, A. HIRSCHL, E. BUCHBERGER, B. BINDER, I. VOLF

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 799-809

]
. TLR-2 является рецептором, распознающим пептидогликановые последовательности грамположительных бактерий
[
152
Efficient phagocytosis of periodontopathogens by neutrophils requires plasma factors, platelets and TLR2

A. ASSINGER, M. LAKY, G. SCHABBAUER, A. HIRSCHL, E. BUCHBERGER, B. BINDER, I. VOLF

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 799-809

]
. Стимуляция двумя типичными пародонтопатогенами (Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans) вызывала формирование гетероагрегатов тромбоцитов и нейтрофилов
[
153,
Stimulation of Toll-Like Receptor 2 in Human Platelets Induces a Thromboinflammatory Response Through Activation of Phosphoinositide 3-Kinase

P. Blair, S. Rex, O. Vitseva, L. Beaulieu, K. Tanriverdi, S. Chakrabarti, C. Hayashi, C. Genco, M. Iafrati, J. Freedman

Circulation Research. 2009, 104, 346-354

154
Periodontopathogens induce expression of CD40L on human platelets via TLR2 and TLR4

A. Assinger, M. Laky, S. Badrnya, A. Esfandeyari, I. Volf

Thrombosis Research. 2012, 130, e73-e78

]
, и это значительно усиливало элиминацию бактерий нейтрофилами
[
153
Stimulation of Toll-Like Receptor 2 in Human Platelets Induces a Thromboinflammatory Response Through Activation of Phosphoinositide 3-Kinase

P. Blair, S. Rex, O. Vitseva, L. Beaulieu, K. Tanriverdi, S. Chakrabarti, C. Hayashi, C. Genco, M. Iafrati, J. Freedman

Circulation Research. 2009, 104, 346-354

]
. При этом формирование гетероагрегатов значительно снижалось при ингибировании TLR2
[
153
Stimulation of Toll-Like Receptor 2 in Human Platelets Induces a Thromboinflammatory Response Through Activation of Phosphoinositide 3-Kinase

P. Blair, S. Rex, O. Vitseva, L. Beaulieu, K. Tanriverdi, S. Chakrabarti, C. Hayashi, C. Genco, M. Iafrati, J. Freedman

Circulation Research. 2009, 104, 346-354

]
. На поверхности тромбоцитов в достаточном количестве также присутствует рецептор TLR4, узнающий компоненты клеточной стенки грамотрицательных бактерий - липополисахариды (LPS)
[
146
Platelet Toll-Like Receptors Mediate Thromboinflammatory Responses in Patients With Essential Thrombocythemia

C. Marín Oyarzún, A. Glembotsky, N. Goette, P. Lev, G. De Luca, M. Baroni Pietto, B. Moiraghi, M. Castro Ríos, A. Vicente, R. Marta, M. Schattner, P. Heller

Frontiers in Immunology. 2020, 11, None

]
. Однако, инкубация LPS с тромбоцитами скорее оказывает ингибирующий эффект
[
]
. Аналогично TLR2, TLR4 может иметь большую значимость прежде всего при иммунных, а не при тромботических ответах. Например, показано, что стимуляция тромбоцитов LPS может индуцировать в них синтез медиаторов воспаления, включая IL-1β
, sCD40L
[
155
The Role of Human Platelet Preparation for Toll-Like Receptors 2 and 4 Related Platelet Responsiveness

J. Koessler, M. Niklaus, K. Weber, A. Koessler, S. Kuhn, M. Boeck, A. Kobsar

TH Open. 2019, 03, e94-e102

]
, RANTES
[
156
Lipopolysaccharide as trigger of platelet aggregation via eicosanoid over-production

C. Nocella, R. Carnevale, S. Bartimoccia, M. Novo, R. Cangemi, D. Pastori, C. Calvieri, P. Pignatelli, F. Violi

Thrombosis and Haemostasis. 2017, 117, 1558-1570

]
. Также показано, что LPS могут усиливать продукцию эйкозаноидов и маркеров окислительного стресса
[
157
The role of platelets in mediating a response to human influenza infection

M. Koupenova, H. Corkrey, O. Vitseva, G. Manni, C. Pang, L. Clancy, C. Yao, J. Rade, D. Levy, J. Wang, R. Finberg, E. Kurt-Jones, J. Freedman

Nature Communications. 2019, 10, None

]
. TLR7 экспрессируется в тромбоцитах как на уровне белка, так и на уровне мРНК
[
152
Efficient phagocytosis of periodontopathogens by neutrophils requires plasma factors, platelets and TLR2

A. ASSINGER, M. LAKY, G. SCHABBAUER, A. HIRSCHL, E. BUCHBERGER, B. BINDER, I. VOLF

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 799-809

]
. Недавние данные продемонстрировали потенциальную роль тромбоцитарного TLR7 при реакции организма на вирус гриппа
[
158
Revisiting Platelets and Toll-Like Receptors (TLRs): At the Interface of Vascular Immunity and Thrombosis

K. Hally, S. Fauteux-Daniel, H. Hamzeh-Cognasse, P. Larsen, F. Cognasse

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 6150

]
, состоящую в эндоцитозе вирионов, формированию гетероагрегатов тромбоцит-нейтрофил и последующей активации нейтрофилов по причине повышенной экспрессии CD62P и CD40L на тромбоцитах
[
158,
Revisiting Platelets and Toll-Like Receptors (TLRs): At the Interface of Vascular Immunity and Thrombosis

K. Hally, S. Fauteux-Daniel, H. Hamzeh-Cognasse, P. Larsen, F. Cognasse

International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 6150

159
T granules in human platelets function in TLR9 organization and signaling

J. Thon, C. Peters, K. Machlus, R. Aslam, J. Rowley, H. Macleod, M. Devine, T. Fuchs, A. Weyrich, J. Semple, R. Flaumenhaft, J. Italiano

Journal of Cell Biology. 2012, 198, 561-574

]
. Функциональный TLR9 также присутствует на тромбоцитах, при этом он TLR9 локализуется в примембранных областях, будучи заключённым в везикулы
[
160
Engagement of Platelet Toll-Like Receptor 9 by Novel Endogenous Ligands Promotes Platelet Hyperreactivity and Thrombosis

S. Panigrahi, Y. Ma, L. Hong, D. Gao, X. West, R. Salomon, T. Byzova, E. Podrez

Circulation Research. 2013, 112, 103-112

]
. Было показано, что стимуляция рядом тромботических агонистов привеодит к перемещению TLR9 из внутриклеточных везикул на мембрану с помощью ассоциированных с везикулами мембранных белков VAMP7 и VAMP8. Экспрессию TLR9 на поверхности тромбоцитов усиливает захват и эндоцитоз ДНК, лиганда TLR9
[
160
Engagement of Platelet Toll-Like Receptor 9 by Novel Endogenous Ligands Promotes Platelet Hyperreactivity and Thrombosis

S. Panigrahi, Y. Ma, L. Hong, D. Gao, X. West, R. Salomon, T. Byzova, E. Podrez

Circulation Research. 2013, 112, 103-112

]
. Также, было показано, что карбокси (алкилпиррол) белковые аддукты (CAP), конечные продукты окисления липидов, являются ещё одним лигандом для TLR9 тромбоцитов
[
161
Mitochondria in lung biology and pathology: more than just a powerhouse

P. Schumacker, M. Gillespie, K. Nakahira, A. Choi, E. Crouser, C. Piantadosi, J. Bhattacharya

American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 2014, 306, L962-L974

]
, вызывающим активацию интегринов и секрецию альфа-гранул .

Помимо PAMP-индуцированной сигнализации, тромбоциты также могут быть источником DAMP, которые будут узнаваться TLR-рецепторами. Так, эндогенные митохондриальные DAMP, митохондриальная ДНК (мтДНК), а также митохондриальные белки, являются мощными иммуностимуляторами

. Структура и провоспалительные эффекты мтДНК подобны, если не идентичны, бактериальной ДНК из-за ее протеобактериального происхождения. Это сходство распространяется на способность мтДНК стимулировать TLR9 благодаря наличию в них мтДНК неметилированных динуклеотидов CpG
[
163,
Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury

Q. Zhang, M. Raoof, Y. Chen, Y. Sumi, T. Sursal, W. Junger, K. Brohi, K. Itagaki, C. Hauser

Nature. 2010, 464, 104-107

164
Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation

L. Boudreau, A. Duchez, N. Cloutier, D. Soulet, N. Martin, J. Bollinger, A. Paré, M. Rousseau, G. Naika, T. Lévesque, C. Laflamme, G. Marcoux, G. Lambeau, R. Farndale, M. Pouliot, H. Hamzeh-Cognasse, F. Cognasse, O. Garraud, P. Nigrovic, H. Guderley, S. Lacroix, L. Thibault, J. Semple, M. Gelb, E. Boilard

Blood. 2014, 124, 2173-2183

]
. мтДНК может стимулировать нейтрофилы и индуцировать нетоз
[
165
Mitochondrial DAMPs Increase Endothelial Permeability through Neutrophil Dependent and Independent Pathways

S. Sun, T. Sursal, Y. Adibnia, C. Zhao, Y. Zheng, H. Li, L. Otterbein, C. Hauser, K. Itagaki

PLoS ONE. 2013, 8, e59989

]
. мтДНК также может индуцировать проницаемость эндотелиальных клеток, тем самым облегчая передачу локализованного иммуногенного ответа на дистальные органы
[
166
Toll-like receptor 9–dependent activation by DNA-containing immune complexes is mediated by HMGB1 and RAGE

J. Tian, A. Avalos, S. Mao, B. Chen, K. Senthil, H. Wu, P. Parroche, S. Drabic, D. Golenbock, C. Sirois, J. Hua, L. An, L. Audoly, G. La Rosa, A. Bierhaus, P. Naworth, A. Marshak-Rothstein, M. Crow, K. Fitzgerald, E. Latz, P. Kiener, A. Coyle

Nature Immunology. 2007, 8, 487-496

]
.

HMGB1 - еще один хорошо описанный DAMP, который пассивно выделяется как при клеточном стрессе, так и при некрозе: HMGB1 паракринным образом сигнализирует об «опасности» соседним клеткам. Показано, что HMGB1 связывается с несколькими членами семейства TLR: HMGB1 может образовывать комплекс с CpG-ДНК и связываться с TLR9 и RAGE, увеличивая продукцию цитокинов в плазматических дендритных клетках

[
167
Induction of inflammatory and immune responses by HMGB1–nucleosome complexes: implications for the pathogenesis of SLE

V. Urbonaviciute, B. Fürnrohr, S. Meister, L. Munoz, P. Heyder, F. De Marchis, M. Bianchi, C. Kirschning, H. Wagner, A. Manfredi, J. Kalden, G. Schett, P. Rovere-Querini, M. Herrmann, R. Voll

Journal of Experimental Medicine. 2008, 205, 3007-3018

]
. При связывании HMGB1 с нуклеосомами макрофаги и дендритные клетки активируются через TLR2
.

Наконец, на тромбоцитах также присутствуют и рецепторы к компонентам системы комплемента: C3aR, C5aR. Показано, что при их активации происходит секреция тромбоцитарных гранул и выставление P-селектина, что также привлекает иммунные клетки. Также при секреции гранул происходит выставление C1qR-рецептора. Показано, что у пациентов с коронарным синдромом экспрессия данных рецепторов на поверхности тромбоцитов увеличена

.

Ингибирование активации тромбоцитов

Тромбоцит поддерживается в неактивированном состоянии высокими концентрациями циклических нуклеотидов. Повышение концентрации cAMP стимулирует рецептор к простациклину, IP, ассоциированный с Gs белками

[
170
PGE1 and PGE2 modify platelet function through different prostanoid receptors

D. Iyú, M. Jüttner, J. Glenn, A. White, A. Johnson, S. Fox, S. Heptinstall

Prostaglandins & Other Lipid Mediators. 2011, 94, 9-16

]
. Помимо простациклина, на поверхности тромбоцитов также рецепторы к простагландину Е2 (PGE2): EP3, вызывающий понижение концентрации цАМФ Gi-зависимым образом, и EP4, напротив, повышающий концентрацию цАМФ в тромбоцитах Gs-зависимо
[
171
Endothelial Function and Dysfunction

J. Deanfield, J. Halcox, T. Rabelink

Circulation. 2007, 115, 1285-1295

]
. Повышение концентрации cGMP происходит под действием оксид азота (NO), синтезируемого здоровым эндотелием
[
53,
A Boolean view separates platelet activatory and inhibitory signalling as verified by phosphorylation monitoring including threshold behaviour and integrin modulation

M. Mischnik, D. Boyanova, K. Hubertus, J. Geiger, N. Philippi, M. Dittrich, G. Wangorsch, J. Timmer, T. Dandekar

Molecular BioSystems. 2013, 9, 1326

172
Platelet-Derived Nitric Oxide Signaling and Regulation

E. Gkaliagkousi, J. Ritter, A. Ferro

Circulation Research. 2007, 101, 654-662

]
. Также NO может быть синтезирован тромбоцитарными NO-синтазами NOS2 и NOS3
[
173
Nitric oxide specifically inhibits integrin-mediated platelet adhesion and spreading on collagen

W. ROBERTS, R. RIBA, S. HOMER-VANNIASINKAM, R. FARNDALE, K. NASEEM

Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2008, 6, 2175-2185

]
. В тромбоцитах NO стимулирует растворимую гуанилатциклазу sGC, что увеличивает синтез cGMP из GTP. Повышение уровня активности растворимой GC (sGC), приводит к падению уровня внутриклеточного кальция
[
51,
174
Platelets

Michelson AD.

Elsevier. 2013, None, None

]
. Также NO способен катализировать фосфорилирование рецепторов к TXA2, тем самым предотвращая активацию тромбоцитов TXA2
[
174
Platelets

Michelson AD.

Elsevier. 2013, None, None

]
. Кроме того, в последнее время было показано, что NO также влияет на активацию интегринов α2β1 и aIIbb3
[
174
Platelets

Michelson AD.

Elsevier. 2013, None, None

]
. Хотя NO оказывает тормозящее действие на агрегацию тромбоцитов при высоких его концентрациях, он скорее стимулирует секрецию гранул, действуя через сGМP путь при низких концентрациях (бифазный эффект) in vivo
.

Заключение

Выполнение физиологических задач тромбоцитами неразрывно связано с необходимостью одновременно получать и интерпретировать большое количество внешних сигналов. Более того, в некоторых случаях эти сигналы могут другу другу противоречить. Благодаря сложной и разветвлённой сети рецепторов, запускающей GPCR или тирозинкиназную сигнализацию, тромбоциты могут «справляться с таким давлением» и адекватно реагировать на возникающие нарушения целостности кровеносных сосудов. Более того, пути сигнализации в тромбоцитах могут синергически усиливать друг-друга (тирозинкиназная и GPCR) или же, напротив, подавлять (cAMP/cGMP сигнализация). Интересно, что на тромбоцитах также есть и потенциал-зависимые рецепторы, такие как каналы Kv1.3 и APMPA

[
]
. Для такой уникальной клетки как тромбоцит подобный набор рецепторов становится принципиально необходимым, так как тромбоциты могут минимально влиять на свой белковый состав в процессе жизни, в отличие от ядерных клеток.

Интересно, что синергическое усиление путей активации тромбоцитов может происходить как в рамках одного типа сигнализации, так и для разных типов. Так, с одной стороны АДФ индуцирует кальциевую сигнализацию и активацию тромбоцитарных интегринов aIIbb3 Gq-зависимым образом через рецептор P2Y1. С другой стороны, АДФ также может снижать концентрацию cAMP Gi-зависимым образом через рецептор P2Y12, что многократно усиливает активацию тромбоцитов. С другой стороны, тирозинкиназная ветвь сигнализации и GPCR-сигнализация могут усиливать друг друга: обе данные ветви сигнализации индуцируют активацию PI3K, которая запускает фосфоинозитидную ветвь сигнализации. Более того, активация фосфоинозитидной сигнализации при outside-in сигнализации через тромбоцитарные интегрины aIIbb3 также становится важным элементом синергического усиления активации тромбоцитов.

Взаимодействие путей внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах также позволяет им активироваться с уникальной быстротой: тромбоциты часто становятся первой линией ответа организма на патологии. Более того, тромбоциты являются и важными участниками иммунных процессов, таких как ответ организма на бактериальную или вирусную инфекцию или же для модуляции ответов компонентов клеточного иммунитета. Вторичные мессенджеры, управляющие всеми этими ответами тромбоцитов и обеспечивающие взаимодействие между активационными сигналами и функциональными ответами тромбоцитов станут предметом следующей части нашего цикла обзоров.

Вклад авторов

A.A.M. создавал рисунки, писал текст и редактировал статью; M.A.П. руководил проектом, писал текст и редактировал статью. Все авторы прочитали и согласовали опубликованную версию рукописи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Стипендии Президента РФ СП 2675.2019.4

Библиографические ссылки статьи:

  1. Hemostasis and thrombosis beyond biochemistry: roles of geometry, flow and diffusion

    M. Panteleev, N. Dashkevich, F. Ataullakhanov

    Thrombosis Research. 2015, 136, 699-711

  2. Novel mouse hemostasis model for real-time determination of bleeding time and hemostatic plug composition

    T. Getz, R. Piatt, B. Petrich, D. Monroe, N. Mackman, W. Bergmeier

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 417-425

  3. Platelets and vascular integrity

    C. Deppermann

    Platelets. 2018, 29, 549-555

  4. Physiological and pathophysiological aspects of blood platelet activation through CLEC-2 receptor

    A. Martyanov, V. Kaneva, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Oncohematology. 2018, 13, 83-90

  5. How platelets safeguard vascular integrity

    B. HO-TIN-NOÉ, M. DEMERS, D. WAGNER

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 56-65

  6. Platelet ITAM signaling is critical for vascular integrity in inflammation

    Yacine Boulaftali, Paul R. Hess, Todd M. Getz, Agnieszka Cholka, Moritz Stolla, Nigel Mackman, A. Phillip Owens III, Jerry Ware, Mark L. Kahn, Wolfgang Bergmeier

    The Journal of Clinical Investigation. 2013, 123 (2), 908-916

  7. Editorial: Platelets and Immune Responses During Thromboinflammation

    M. Schattner, C. Jenne, S. Negrotto, B. Ho-Tin-Noe

    Frontiers in Immunology. 2020, 11,

  8. The dual role of platelet-innate immune cell interactions in thrombo-inflammation

    J. Rayes, J. Bourne, A. Brill, S. Watson

    Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 2020, 4, 23-35

  9. Lipopolysaccharide Signaling without a Nucleus: Kinase Cascades Stimulate Platelet Shedding of Proinflammatory IL-1β–Rich Microparticles

    G. Brown, T. McIntyre

    The Journal of Immunology. 2011, 186, 5489-5496

  10. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses.

    A. Sveshnikova, M. Stepanyan, M. Panteleev

    Systems Biology and Physiology Reports. 2021, 1, 20-28

  11. Platelets: production, morphology and ultrastructure

    Thon JN, Italiano JE

    Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, , 3-22

  12. Platelet shape change and spreading

    Aslan JE, Itakura A, Gertz JM, McCarty OJT

    Methods in Molecular Biology. 2012, 788, 91-100

  13. Tubulin in Platelets: When the Shape Matters

    E. Cuenca-Zamora, F. Ferrer-Marín, J. Rivera, R. Teruel-Montoya

    International Journal of Molecular Sciences. 2019, 20, 3484

  14. New explanations for old observations: marginal band coiling during platelet activation

    K. Sadoul

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 333-346

  15. Actin dynamics in platelets

    Bearer EL, Prakash JM, Li Z.

    International Review of Cytology. 2002, 217, 137-82

  16. Platelet Shape Changes and Cytoskeleton Dynamics as Novel Therapeutic Targets for Anti-Thrombotic Drugs

    E. Shin, H. Park, J. Noh, K. Lim, J. Chung

    Biomolecules & Therapeutics. 2017, 25, 223-230

  17. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways

    J. Burkhart, M. Vaudel, S. Gambaryan, S. Radau, U. Walter, L. Martens, J. Geiger, A. Sickmann, R. Zahedi

    Blood. 2012, 120, e73-e82

  18. Platelet signaling

    Stalker TJ, Newman DK, Ma P, Wannemacher KM, Brass LF

    Handbook of Experimental Pharmacology. 2012, , 59-85

  19. Regulation of Platelet Activation and Coagulation and Its Role in Vascular Injury and Arterial Thrombosis

    M. Tomaiuolo, L. Brass, T. Stalker

    Interventional Cardiology Clinics. 2017, 6, 1-12

  20. RAP GTPases and platelet integrin signaling

    L. Stefanini, W. Bergmeier

    Platelets. 2019, 30, 41-47

  21. Platelet Secretion. In: Michelson AD, editor. Platelets (Fourth Edition)

    Flaumenhaft R, Sharda A

    Academic Press. 2019, , 349-70

  22. Sorting machineries: how platelet-dense granules differ from α-granules

    Y. Chen, Y. Yuan, W. Li

    Bioscience Reports. 2018, 38,

  23. Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling

    A. Sveshnikova, A. Balatskiy, A. Demianova, T. Shepelyuk, S. Shakhidzhanov, M. Balatskaya, A. Pichugin, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 2045-2057

  24. Procoagulant Platelets Form an α-Granule Protein-covered “Cap” on Their Surface That Promotes Their Attachment to Aggregates

    A. Abaeva, M. Canault, Y. Kotova, S. Obydennyy, A. Yakimenko, N. Podoplelova, V. Kolyadko, H. Chambost, A. Mazurov, F. Ataullakhanov, A. Nurden, M. Alessi, M. Panteleev

    Journal of Biological Chemistry. 2013, 288, 29621-29632

  25. Regulating thrombus growth and stability to achieve an optimal response to injury

    L. BRASS, K. WANNEMACHER, P. MA, T. STALKER

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2011, 9, 66-75

  26. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface

    D. Nechipurenko, N. Receveur, A. Yakimenko, T. Shepelyuk, A. Yakusheva, R. Kerimov, S. Obydennyy, A. Eckly, C. Léon, C. Gachet, E. Grishchuk, F. Ataullakhanov, P. Mangin, M. Panteleev

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2019, 39, 37-47

  27. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives

    P. van der Meijden, J. Heemskerk

    Nature Reviews Cardiology. 2019, 16, 166-179

  28. Computational biology analysis of platelet signaling reveals roles of feedbacks through phospholipase C and inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase in controlling amplitude and duration of calcium oscillations

    F. Balabin, A. Sveshnikova

    Mathematical Biosciences. 2016, 276, 67-74

  29. Dynamics of calcium spiking, mitochondrial collapse and phosphatidylserine exposure in platelet subpopulations during activation

    S. Obydennyy, A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2016, 14, 1867-1881

  30. Control of Platelet CLEC-2-Mediated Activation by Receptor Clustering and Tyrosine Kinase Signaling

    A. Martyanov, F. Balabin, J. Dunster, M. Panteleev, J. Gibbins, A. Sveshnikova

    Biophysical Journal. 2020, 118, 2641-2655

  31. Compartmentalized calcium signaling triggers subpopulation formation upon platelet activation through PAR1

    A. Sveshnikova, F. Ataullakhanov, M. Panteleev

    Molecular BioSystems. 2015, 11, 1052-1060

  32. Calcium signaling in platelets

    D. VARGA-SZABO, A. BRAUN, B. NIESWANDT

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009, 7, 1057-1066

  33. Agonist-evoked inositol trisphosphate receptor (IP3R) clustering is not dependent on changes in the structure of the endoplasmic reticulum

    M. Chalmers, M. Schell, P. Thorn

    Biochemical Journal. 2006, 394, 57-66

  34. Mechanisms of increased mitochondria-dependent necrosis in Wiskott-Aldrich syndrome platelets

    S. Obydennyi, E. Artemenko, A. Sveshnikova, A. Ignatova, T. Varlamova, S. Gambaryan, G. Lomakina, N. Ugarova, I. Kireev, F. Ataullakhanov, G. Novichkova, A. Maschan, A. Shcherbina, M. Panteleev

    Haematologica. 2020, 105, 1095-1106

  35. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol

    A. Södergren, S. Ramström

    Scientific Reports. 2018, 8,

  36. Программируемая клеточная смерть и функциональная активность тромбоцитов при онкогематологических заболеваниях

    А. Мартьянов, А. Игнатова, Г. Свидельская, Е. Пономаренко, С. Гамбарян, А. Свешникова, М. Пантелеев

    Биохимия. 2020, 85, 1489-1499

  37. Expression, Purification, and Regulation of Two Isoforms of the Inositol 1,4,5-Trisphosphate 3-Kinase

    P. Woodring, J. Garrison

    Journal of Biological Chemistry. 1997, 272, 30447-30454

  38. Glutamate regulation of calcium and IP3 oscillating and pulsating dynamics in astrocytes

    M. De Pittà, M. Goldberg, V. Volman, H. Berry, E. Ben-Jacob

    Journal of Biological Physics. 2009, 35, 383-411

  39. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinases: functions and regulations

    H. XIA, G. YANG

    Cell Research. 2005, 15, 83-91

  40. Regulation of platelet plug formation by phosphoinositide metabolism

    S. Min, C. Abrams

    Blood. 2013, 122, 1358-1365

  41. Platelet Signal Transduction. In: Michelson AD, editor. Platelets (Fourth Edition)

    Lee RH, Stefanini L, Bergmeier W.

    Academic Press. 2019, , 329-48

  42. Recruitment and regulation of phosphatidylinositol phosphate kinase type 1γ by the FERM domain of talin

    G. Di Paolo, L. Pellegrini, K. Letinic, G. Cestra, R. Zoncu, S. Voronov, S. Chang, J. Guo, M. Wenk, P. De Camilli

    Nature. 2002, 420, 85-89

  43. Platelets lacking PIP5KIγ have normal integrin activation but impaired cytoskeletal-membrane integrity and adhesion

    Y. Wang, L. Zhao, A. Suzuki, L. Lian, S. Min, Z. Wang, R. Litvinov, T. Stalker, T. Yago, A. Klopocki, D. Schmidtke, H. Yin, J. Choi, R. McEver, J. Weisel, J. Hartwig, C. Abrams

    Blood. 2013, 121, 2743-2752

  44. The role of class I, II and III PI 3-kinases in platelet production and activation and their implication in thrombosis

    C. Valet, S. Severin, G. Chicanne, P. Laurent, F. Gaits-Iacovoni, M. Gratacap, B. Payrastre

    Advances in Biological Regulation. 2016, 61, 33-41

  45. Impact of the PI3-kinase/Akt pathway on ITAM and hemITAM receptors: Haemostasis, platelet activation and antithrombotic therapy

    A. Moroi, S. Watson

    Biochemical Pharmacology. 2015, 94, 186-194

  46. Structure and lipid-binding properties of the kindlin-3 pleckstrin homology domain

    T. Ni, A. Kalli, F. Naughton, L. Yates, O. Naneh, M. Kozorog, G. Anderluh, M. Sansom, R. Gilbert

    Biochemical Journal. 2017, 474, 539-556

  47. Different roles of SHIP1 according to the cell context: The example of blood platelets

    M. Gratacap, S. Séverin, G. Chicanne, M. Plantavid, B. Payrastre

    Advances in Enzyme Regulation. 2008, 48, 240-252

  48. SH2-containing inositol 5-phosphatases 1 and 2 in blood platelets: their interactions and roles in the control of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate levels

    S. GIURIATO, X. PESESSE, S. BODIN, T. SASAKI, C. VIALA, E. MARION, J. PENNINGER, S. SCHURMANS, C. ERNEUX, B. PAYRASTRE

    Biochemical Journal. 2003, 376, 199-207

  49. Deficiency of Src homology 2 domain–containing inositol 5-phosphatase 1 affects platelet responses and thrombus growth

    S. Séverin, M. Gratacap, N. Lenain, L. Alvarez, E. Hollande, J. Penninger, C. Gachet, M. Plantavid, B. Payrastre

    Journal of Clinical Investigation. 2007, 117, 944-952

  50. Effects of bacterial lipopolysaccharides on platelet function: inhibition of weak platelet activation

    A. Martyanov, A. Maiorov, A. Filkova, A. Ryabykh, G. Svidelskaya, E. Artemenko, S. Gambaryan, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    Scientific Reports. 2020, 10,

  51. GMP and cGMP-dependent protein kinase in platelets and blood cells

    Walter U, Gambaryan S

    Handbook of Experimental Pharmacology. 2009, , 533-48

  52. A review and discussion of platelet nitric oxide and nitric oxide synthase: do blood platelets produce nitric oxide from l-arginine or nitrite?

    S. Gambaryan, D. Tsikas

    Amino Acids. 2015, 47, 1779-1793

  53. A Boolean view separates platelet activatory and inhibitory signalling as verified by phosphorylation monitoring including threshold behaviour and integrin modulation

    M. Mischnik, D. Boyanova, K. Hubertus, J. Geiger, N. Philippi, M. Dittrich, G. Wangorsch, J. Timmer, T. Dandekar

    Molecular BioSystems. 2013, 9, 1326

  54. Activation of Platelet Function Through G Protein–Coupled Receptors

    S. Offermanns

    Circulation Research. 2006, 99, 1293-1304

  55. Kinetic diversity in G-protein-coupled receptor signalling

    V. Katanaev, M. Chornomorets

    Biochemical Journal. 2007, 401, 485-495

  56. Synergistic Activation of Phospholipase C-β3 by Gαq and Gβγ Describes a Simple Two-State Coincidence Detector

    F. Philip, G. Kadamur, R. Silos, J. Woodson, E. Ross

    Current Biology. 2010, 20, 1327-1335

  57. A quantitative characterization of the yeast heterotrimeric G protein cycle

    T. Yi, H. Kitano, M. Simon

    Proceedings of the National Academy of Sciences. 2003, 100, 10764-10769

  58. Receptor-Mediated Activation of Heterotrimeric G-Proteins in Living Cells

    C. Janetopoulos

    Science. 2001, 291, 2408-2411

  59. A Direct and Functional Interaction Between Go and Rab5 During G Protein-Coupled Receptor Signaling

    V. Purvanov, A. Koval, V. Katanaev

    Science Signaling. 2010, 3, ra65-ra65

  60. Double Suppression of the Gα Protein Activity by RGS Proteins

    C. Lin, A. Koval, S. Tishchenko, A. Gabdulkhakov, U. Tin, G. Solis, V. Katanaev

    Molecular Cell. 2014, 53, 663-671

  61. High capacity in G protein-coupled receptor signaling

    A. Keshelava, G. Solis, M. Hersch, A. Koval, M. Kryuchkov, S. Bergmann, V. Katanaev

    Nature Communications. 2018, 9,

  62. G PROTEIN βγ SUBUNITS

    D. Clapham, E. Neer

    Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 1997, 37, 167-203

  63. Biochemical and pharmacological control of the multiplicity of coupling at G-protein-coupled receptors

    E. Hermans

    Pharmacology & Therapeutics. 2003, 99, 25-44

  64. Bifurcation of Lipid and Protein Kinase Signals of PI3K to the Protein Kinases PKB and MAPK

    T. Bondeva

    Science. 1998, 282, 293-296

  65. Synergistic Activation of Phospholipase C-β3 by Gαq and Gβγ Describes a Simple Two-State Coincidence Detector

    F. Philip, G. Kadamur, R. Silos, J. Woodson, E. Ross

    Current Biology. 2010, 20, 1327-1335

  66. The actin-binding protein profilin binds to PIP2 and inhibits its hydrolysis by phospholipase C

    P. Goldschmidt-Clermont, L. Machesky, J. Baldassare, T. Pollard

    Science. 1990, 247, 1575-1578

  67. Structure, Function, and Control of Phosphoinositide-Specific Phospholipase C

    M. Rebecchi, S. Pentyala

    Physiological Reviews. 2000, 80, 1291-1335

  68. Catalysis by Phospholipase C δ1 Requires That Ca2+ Bind to the Catalytic Domain, but Not the C2 Domain

    J. Grobler, J. Hurley

    Biochemistry. 1998, 37, 5020-5028

  69. Activation of phospholipase C-beta 2 mutants by G protein alpha q and beta gamma subunits

    Lee SB, Shin SH, Hepler JR, Gilman AG, Rhee SG.

    Journal of Biological Chemistry. 1993, 268, 25952–7

  70. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways

    J. Burkhart, M. Vaudel, S. Gambaryan, S. Radau, U. Walter, L. Martens, J. Geiger, A. Sickmann, R. Zahedi

    Blood. 2012, 120, e73-e82

  71. Protein Kinase C in Oncogenic Transformation and Cell Polarity. In: Kramer IjM, editor. Signal Transduction (Third Edition)

    Kramer IjM.

    Boston: Academic Press. 2016, , 529–88

  72. Purification and characterization of cytosolic diacylglycerol kinases of human platelets.

    Y. Yada, T. Ozeki, H. Kanoh, Y. Nozawa

    Journal of Biological Chemistry. 1990, 265, 19237-19243

  73. Heterodimeric Phosphoinositide 3-Kinase Consisting of p85 and p110β Is Synergistically Activated by the βγ Subunits of G Proteins and Phosphotyrosyl Peptide

    H. Kurosu, T. Maehama, T. Okada, T. Yamamoto, S. Hoshino, Y. Fukui, M. Ui, O. Hazeki, T. Katada

    Journal of Biological Chemistry. 1997, 272, 24252-24256

  74. Dichotomous regulation of myosin phosphorylation and shape change by Rho-kinase and calcium in intact human platelets

    M Bauer, M Retzer, J I Wilde, P Maschberger, M Essler, M Aepfelbacher, S P Watson, W Siess

    Blood. 1999, , 1665–72

  75. Platelet Adenylyl Cyclase Activity: A Biological Marker for Major Depression and Recent Drug Use

    L. Hines, B. Tabakoff

    Biological Psychiatry. 2005, 58, 955-962

  76. G-Protein–Coupled Receptors Signaling Pathways in New Antiplatelet Drug Development

    P. Gurbel, A. Kuliopulos, U. Tantry

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2015, 35, 500-512

  77. Fueling Platelets

    S. Whiteheart

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2017, 37, 1592-1594

  78. Signaling through Gi Family Members in Platelets

    J. Yang, J. Wu, H. Jiang, R. Mortensen, S. Austin, D. Manning, D. Woulfe, L. Brass

    Journal of Biological Chemistry. 2002, 277, 46035-46042

  79. G-Protein Coupled Receptor Resensitization - Appreciating the Balancing Act of Receptor Function

    M. L. Mohan, N. T. Vasudevan, M. K. Gupta, E. E. Martelli, S. V. Naga Prasad

    Current Molecular Pharmacology. 2013, 5, 350-361

  80. Heterogeneity of Integrin αIIbβ3 Function in Pediatric Immune Thrombocytopenia Revealed by Continuous Flow Cytometry Analysis

    A. Martyanov, D. Morozova, M. Sorokina, A. Filkova, D. Fedorova, S. Uzueva, E. Suntsova, G. Novichkova, P. Zharkov, M. Panteleev, A. Sveshnikova

    International Journal of Molecular Sciences. 2020, 21, 3035

  81. Domains specifying thrombin–receptor interaction

    T. Vu, V. Wheaton, D. Hung, I. Charo, S. Coughlin

    Nature. 1991, 353, 674-677

  82. RhoA downstream of Gq and G12/13 pathways regulates protease-activated receptor-mediated dense granule release in platelets

    J. Jin, Y. Mao, D. Thomas, S. Kim, J. Daniel, S. Kunapuli

    Biochemical Pharmacology. 2009, 77, 835-844

  83. Primary haemostasis: newer insights

    M. Berndt, P. Metharom, R. Andrews

    Haemophilia. 2014, 20, 15-22

  84. New Fundamentals in Hemostasis

    H. Versteeg, J. Heemskerk, M. Levi, P. Reitsma

    Physiological Reviews. 2013, 93, 327-358

  85. Adenosine diphosphate (ADP)–induced thromboxane A2generation in human platelets requires coordinated signaling through integrin αIIbβ3 and ADP receptors

    J. Jin, T. Quinton, J. Zhang, S. Rittenhouse, S. Kunapuli

    Blood. 2002, 99, 193-198

  86. Mechanisms of platelet activation: Need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis

    L. Jennings

    Thrombosis and Haemostasis. 2009, 102, 248-257

  87. Platelet adhesion, shape change, and aggregation: rapid initiation and signal transduction events

    A. Gear

    Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 1994, 72, 285-294

  88. Defective platelet activation in Gαq-deficient mice

    S. Offermanns, C. Toombs, Y. Hu, M. Simon

    Nature. 1997, 389, 183-186

  89. Metabolism of adenine nucleotides in human blood.

    S. Coade, J. Pearson

    Circulation Research. 1989, 65, 531-537

  90. Demonstration of a novel ecto-enzyme on human erythrocytes, capable of degrading ADP and of inhibiting ADP-induced platelet aggregation

    J. LUTHJE, A. SCHOMBURG, A. OGILVIE

    European Journal of Biochemistry. 1988, 175, 285-289

  91. The evolution of megakaryocytes to platelets

    P. Nurden, C. Poujol, A. Nurden

    Baillière's Clinical Haematology. 1997, 10, 1-27

  92. Possible involvement of cytoskeleton in collagen-stimulated activation of phospholipases in human platelets

    Nakano T, Hanasaki K, Arita H.

    Journal of Biological Chemistry. 1989, 264, 5400-6

  93. Detection of local ATP release from activated platelets using cell surface-attached firefly luciferase

    R. Beigi, E. Kobatake, M. Aizawa, G. Dubyak

    American Journal of Physiology-Cell Physiology. 1999, 276, C267-C278

  94. Persistence of thromboxane A2-like material and platelet release-inducing activity in plasma.

    J. Smith, C. Ingerman, M. Silver

    Journal of Clinical Investigation. 1976, 58, 1119-1122

  95. Signaling During Platelet Adhesion and Activation

    Z. Li, M. Delaney, K. O'Brien, X. Du

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2010, 30, 2341-2349

  96. Molecular Mechanisms of SERT in Platelets: Regulation of Plasma Serotonin Levels

    C. Mercado, F. Kilic

    Molecular Interventions. 2010, 10, 231-241

  97. Epinephrine restores platelet functions inhibited by ticagrelor: A mechanistic approach

    A. Martin, D. Zlotnik, G. Bonete, E. Baron, B. Decouture, T. Belleville-Rolland, B. Le Bonniec, S. Poirault-Chassac, M. Alessi, P. Gaussem, A. Godier, C. Bachelot-Loza

    European Journal of Pharmacology. 2020, 866, 172798

  98. Platelet ITAM signaling

    W. Bergmeier, L. Stefanini

    Current Opinion in Hematology. 2013, 20, 445-450

  99. Platelet Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif (ITAM) Signaling and Vascular Integrity

    Y. Boulaftali, P. Hess, M. Kahn, W. Bergmeier

    Circulation Research. 2014, 114, 1174-1184

  100. The Src, Syk, and Tec family kinases: Distinct types of molecular switches

    J. Bradshaw

    Cellular Signalling. 2010, 22, 1175-1184

  101. Src family kinases: at the forefront of platelet activation

    Y. Senis, A. Mazharian, J. Mori

    Blood. 2014, 124, 2013-2024

  102. Dominant Role of the Protein-Tyrosine Phosphatase CD148 in Regulating Platelet Activation Relative to Protein-Tyrosine Phosphatase-1B

    J. Mori, Y. Wang, S. Ellison, S. Heising, B. Neel, M. Tremblay, S. Watson, Y. Senis

    Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2012, 32, 2956-2965

  103. Mechanisms of receptor tyrosine kinase activation in cancer

    Z. Du, C. Lovly

    Molecular Cancer. 2018, 17,

  104. SH2 domains: modulators of nonreceptor tyrosine kinase activity

    P. Filippakopoulos, S. Müller, S. Knapp

    Current Opinion in Structural Biology. 2009, 19, 643-649

  105. SH3 domain ligand binding: What's the consensus and where's the specificity?

    K. Saksela, P. Permi

    FEBS Letters. 2012, 586, 2609-2614

  106. Molecular priming of Lyn by GPVI enables an immune receptor to adopt a hemostatic role

    A. Schmaier, Z. Zou, A. Kazlauskas, L. Emert-Sedlak, K. Fong, K. Neeves, S. Maloney, S. Diamond, S. Kunapuli, J. Ware, L. Brass, T. Smithgall, K. Saksela, M. Kahn

    Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009, 106, 21167-21172

  107. Molecular Mechanism of the Syk Activation Switch

    E. Tsang, A. Giannetti, D. Shaw, M. Dinh, J. Tse, S. Gandhi, H. Ho, S. Wang, E. Papp, J. Bradshaw

    Journal of Biological Chemistry. 2008, 283, 32650-32659

  108. The N-terminal SH2 domain of Syk is required for (hem)ITAM, but not integrin, signaling in mouse platelets

    C. Hughes, B. Finney, F. Koentgen, K. Lowe, S. Watson

    Blood. 2015, 125, 144-154

  109. Dynamics of the Tec-family tyrosine kinase SH3 domains

    J. Roberts, S. Tarafdar, R. Joseph, A. Andreotti, T. Smithgall, J. Engen, T. Wales

    Protein Science. 2016, 25, 852-864

  110. Ibrutinib-associated bleeding: pathogenesis, management and risk reduction strategies

    J. Shatzel, S. Olson, D. Tao, O. McCarty, A. Danilov, T. DeLoughery

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2017, 15, 835-847

  111. The transmembrane adapter LAT plays a central role in immune receptor signalling

    P. Wonerow, S. Watson

    Oncogene. 2001, 20, 6273-6283

  112. Dual-Specificity Phosphatase 3 Deficiency or Inhibition Limits Platelet Activation and Arterial Thrombosis

    L. Musumeci, M. Kuijpers, K. Gilio, A. Hego, E. Théâtre, L. Maurissen, M. Vandereyken, C. Diogo, C. Lecut, W. Guilmain, E. Bobkova, J. Eble, R. Dahl, P. Drion, J. Rascon, Y. Mostofi, H. Yuan, E. Sergienko, T. Chung, M. Thiry, Y. Senis, M. Moutschen, T. Mustelin, P. Lancellotti, J. Heemskerk, L. Tautz, C. Oury, S. Rahmouni

    Circulation. 2015, 131, 656-668

  113. ITIM receptors: more than just inhibitors of platelet activation

    C. Coxon, M. Geer, Y. Senis

    Blood. 2017, 129, 3407-3418

  114. Functional significance of the platelet immune receptors GPVI and CLEC-2

    J. Rayes, S. Watson, B. Nieswandt

    Journal of Clinical Investigation. 2019, 129, 12-23

  115. GPVI and CLEC-2 in hemostasis and vascular integrity

    S. WATSON, J. HERBERT, A. POLLITT

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2010, 8, 1456-1467

  116. Human platelet IgG Fc receptor FcγRIIA in immunity and thrombosis

    M. Arman, K. Krauel

    Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015, 13, 893-908

  117. Signaling by ephrinB1 and Eph kinases in platelets promotes Rap1 activation, platelet adhesion, and aggregation via effector pathways that do not require phosphorylation of ephrinB1

    N. Prévost, D. Woulfe, M. Tognolini, T. Tanaka, W. Jian, R. Fortna, H. Jiang, L. Brass

    Blood. 2004, 103, 1348-1355

  118. SLAM Family Receptors and SAP Adaptors in Immunity

    J. Cannons, S. Tangye, P. Schwartzberg

    Annual Review of Immunology. 2011, 29, 665-705

  119. Platelet Inhibitory Receptors. In: Michelson AD, editor. Platelets (Fourth Edition)

    Nagy Z, Senis YA

    Academic Press. 2019, , 279-93

  120. Minimal regulation of platelet activity by PECAM-1

    T. Dhanjal, E. Ross, J. Auger, O. Mccarty, C. Hughes, Y. Senis, S. Watson

    Platelets. 2007, 18, 56-67

  121. Collagen, Convulxin, and Thrombin Stimulate Aggregation-independent Tyrosine Phosphorylation of CD31 in Platelets

    M. Cicmil, J. Thomas, T. Sage, F. Barry, M. Leduc, C. Bon, J. Gibbins

    Journal of Biological Chemistry. 2000, 275, 27339-27347

  122. Thrombin-induced association of SHP-2 with multiple tyrosine-phosphorylated proteins in human platelets

    C. Edmead, D. Crosby, M. Southcott, A. Poole

    FEBS Letters. 1999, 459, 27-32

  123. Differential association of cytoplasmic signalling molecules SHP-1, SHP-2, SHIP and phospholipase C-γ1 with PECAM-1/CD31

    N. Pumphrey, V. Taylor, S. Freeman, M. Douglas, P. Bradfield, S. Young, J. Lord, M. Wakelam, I. Bird, M. Salmon, C. Buckley

    FEBS Letters. 1999, 450, 77-83

  124. Maintenance of murine platelet homeostasis by the kinase Csk and phosphatase CD148

    J. Mori, Z. Nagy, G. Di Nunzio, C. Smith, M. Geer, R. Al Ghaithi, J. van Geffen, S. Heising, L. Boothman, B. Tullemans, J. Correia, L. Tee, M. Kuijpers, P. Harrison, J. Heemskerk, G. Jarvis, A. Tarakhovsky, A. Weiss, A. Mazharian, Y. Senis

    Blood. 2018, 131, 1122-1144

  125. An Investigation of Hierachical Protein Recruitment to the Inhibitory Platelet Receptor, G6B-b

    C. Coxon, A. Sadler, J. Huo, R. Campbell

    PLoS ONE. 2012, 7, e49543

  126. Fibrin and D-dimer bind to monomeric GPVI

    M. Onselaer, A. Hardy, C. Wilson, X. Sanchez, A. Babar, J. Miller, C. Watson, S. Watson, A. Bonna, H. Philipp